@phdthesis{Skiba2011, author = {Martin Skiba}, title = {Analyse des Wirtszellproteoms und der Expression viraler Proteine in virusinfizierten Gewebekulturen durch quantitative Massenspektrometrie mit metabolisch eingef{\"u}hrten stabilen Isotopen}, journal = {Analysis of host cell proteome and expression of viral proteins in virus-infected cell cultures by quantitative mass spectrometry using metabolically introduced stable isotopes}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001002-7}, year = {2011}, abstract = {Zur Aufkl{\"a}rung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgef{\"u}hrt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochaufl{\"o}sende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum gr{\"o}{\"s}ten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die Komplexit{\"a}t des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine Affinit{\"a}tsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren lie{\"s}. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe Trennsch{\"a}rfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der Affinit{\"a}ten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erh{\"o}hung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bez{\"u}glich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellul{\"a}ren mRNA f{\"u}hrt, als {\"u}berraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellul{\"a}ren-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes Nukle{\"a}res Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den st{\"a}rker negativ geladenen Varianten beobachtet, die m{\"o}glicherweise auf Phosphorylierungen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgef{\"u}hrt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten Ver{\"a}nderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen Vorg{\"a}ngen sein d{\"u}rften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang ver{\"a}ndert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ΔUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anf{\"a}lligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der Probenkomplexit{\"a}t. Ein Vergleich zur Affinit{\"a}tsfestphasenextraktion zeigte, dass ein Gro{\"s}teil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie Splei{\"s}faktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten Ver{\"a}nderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besa{\"s}en pUL29 und pUL39 eine erh{\"o}hte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zus{\"a}tzlich eine Gr{\"o}{\"s}envariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gest{\"u}tztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.}, language = {de} }