@phdthesis{Hoppe2011,
  author    = {Delia Letizia Hoppe},
  title     = {Proteomanalysen humaner S9-Epithelzellen und von Staphylococcus aureus als Grundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion},
  journal    = {Proteomic analysis of human airway S9 cells and Staphylococcus aureus as a basis for research of host-pathogen interactions},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000891-2},
  year      = {2011},
  abstract  = {Infektionen durch Staphyloccocus aureus k{\"o}nnen aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verl{\"a}ufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheits{\"o}konomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. F{\"u}r die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zun{\"a}chst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabh{\"a}ngig werden z.B. Adh{\"a}sine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zun{\"a}chst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellul{\"a}ren Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium f{\"u}r die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellul{\"a}ren Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschlie{\"s}ende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabh{\"a}ngigen Expressionsprofile zu erm{\"o}glichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm f{\"u}r pI 4-7; 11cm u. 18cm f{\"u}r pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Gr{\"o}{\"s}e mit 12,5\% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen F{\"a}rbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzf{\"a}rbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1\_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4\% FCS, 1\% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten f{\"u}r den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden f{\"u}r das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit k{\"o}nnen infektionsassoziierte Ver{\"a}nderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur f{\"u}r Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu erm{\"o}glichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5\%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgef{\"u}hrt. Der Datenvergleich der extrazellul{\"a}ren Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellul{\"a}ren Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Ver{\"a}nderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, station{\"a}r und sp{\"a}t station{\"a}r) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. W{\"a}hrend der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC\_02979, SceD), in der station{\"a}ren Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen erm{\"o}glichen (Schmidt F. et al., 2010).},
  language  = {de}
}