@phdthesis{Wendlandt2019,
  author    = {Tim Wendlandt},
  title     = {Molekularbiologische und physiologische Charakterisierung einer Subtilase aus dem Wurzelexsudat von Nicotiana tabacum},
  journal    = {Molecular biological and physiological characterization of a root-exuded subtilase from Nicotiana tabacum},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-30535},
  pages     = {160},
  year      = {2019},
  abstract  = {Durch zymografische Untersuchungen und Massenspektrometrie (MS) wurden neun Proteasen vom Subtilisin-Typ im Wurzelexsudat von Nicotiana tabacum identifiziert. Ein Peptid-Antik{\"o}rper wurde produziert, der die affinit{\"a}tschromatografische Anreicherung einer tobacco root exuded subtilase (TREXS, XP\_016501597.1) und zweier Isoformen sowie eines Peroxidase-artigen und eines SERK2-artigen Proteins erm{\"o}glichte. Basierend auf dem Subtilase-EST, der in der MS identifiziert worden war, wurde die full-length cDNA von TREXS durch 5'RACE und 3'RACE sequenziert und die gDNA kloniert. Das intronfreie TREXS-Gen codiert eine 756 Aminos{\"a}uren lange Subtilase mit Signalpeptid, I9-Inhibitordom{\"a}ne, PA- und Fn-III-artiger Dom{\"a}ne. Der Nachweis von TREXS-mRNA in Blattgewebe zeigte, dass TREXS nicht exklusiv auf Wurzeln beschr{\"a}nkt ist. Phylogenetische Analysen zeigten, dass SDD1 die {\"a}hnlichste Subtilase aus A. thaliana zu TREXS ist. Mit gro{\"s}er Wahrscheinlichkeit ist TREXS jedoch nicht das Ortholog zu SDD1, weil zum einen struktur{\"a}hnlichere Subtilasen zu SDD1 in Tabak existieren und zum anderen SDD1 an der Auspr{\"a}gung von Stomata in der Blattepidermis beteiligt ist, TREXS hingegen im Wurzelexsudat vorkommt. Das MS-identifizierte SERK2-artige Protein, das bei der Peptid-Antik{\"o}rper-Affinit{\"a}tschromatografie zusammen mit TREXS angereichert wurde, ist Kandidat als Substrat f{\"u}r TREXS, weil es potenziell durch IgG–TREXS–SERK2-like-Interaktion co-angereinigt wurde, die in-silico docking-Vorhersagen zwischen den modellierten Molek{\"u}len von TREXS und SERK2-like einen proteolytisch relevanten Bindungszustand vorhersagt und es strukturelle {\"A}hnlichkeit mit LRP, einem bekannten Substrat der Subtilase P69C, hat. Die transiente Expression rekombinanter TREXS in N. benthamiana war m{\"o}glich, zeigte sich jedoch kritisch gegen{\"u}ber C- und N-terminal fusionierten Anh{\"a}ngen: Transiente Transformation mit TREXS oder TREXS:Strep-tag f{\"u}hrte zu proteolytisch aktivem Protein. Jedoch war der C-terminale Strep-tag nicht funktionell. L{\"a}ngere C-terminale Anh{\"a}nge und auch TREXS-Mutanten mit inaktiviertem katalytischen Zentrum erbrachten kein Genprodukt. C-terminales GFP erbrachte – auch bei mutiertem katalytischen Zentrum – stets nur den GFP-Anteil des Fusionsproteins.},
  language  = {de}
}