@phdthesis{Bogs2011,
  author    = {Jessica Bogs},
  title     = {Molekulare Untersuchungen zur Virulenz und Wirtsadaptation von Influenza-A-Viren vom Subtyp H5N1 an Gefl{\"u}gel und S{\"a}uger},
  journal    = {Molecular investigations of virulence and host adaptation of Influenza A Viruses of subtype H5N1 to poultry and mammals},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001121-6},
  year      = {2011},
  abstract  = {Influenza-A-Viren sind wichtige Pathogene von Mensch und Tier. Als Erreger der klassischen Gefl{\"u}gelpest f{\"u}hren hoch-pathogene avi{\"a}re Influenzaviren (HPAIV) weltweit zu hohen Verlusten in der Gefl{\"u}gelindustrie. Des Weiteren stellen der zoonotische Charakter und das pandemische Potential, vor allem von St{\"a}mmen des Subtyps H5N1, eine ernste gesundheitliche Bedrohung f{\"u}r die Bev{\"o}lkerung dar. Zur Risikobewertung dieser Viren ist es daher notwendig, genetische Marker zu ermitteln, welche die Virulenz und das Wirtsspektrum beeinflussen. F{\"u}r die Identifizierung dieser Virulenzdeterminanten sind Pathogenese-Studien in verschiedenen Tiermodellen wie H{\"u}hnern und M{\"a}usen essenziell. Bisher wurde gezeigt, dass HPAIV aus niedrig-virulenten Vorl{\"a}ufern durch den Erwerb eines polybasischen Spaltmotives im H{\"a}magglutinin (HA) im Zuge der Adaptation an terrestrisches Gefl{\"u}gel hervorgehen. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher die F{\"a}higkeit eines niedrig-pathogenen avi{\"a}ren Influenzavirus (LPAIV) vom Subtyp H5N1 zur Ausbildung eines HPAIV-Ph{\"a}notyps untersucht werden. Dazu wurde das revers-genetische System f{\"u}r das Isolat A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) etabliert und das Virus TG05 generiert. In-vitro konnte die Trypsin-Abh{\"a}ngigkeit als Merkmal von LPAIV best{\"a}tigt werden. Im Huhn verhielt sich dieses Virus avirulent. Durch zielgerichtete Mutagenese wurde die HA-Spaltstelle in ein polybasisches Motiv mutiert und das Virus TG05poly generiert. Das Virus war wie ein HPAIV zur in-vitro-Replikation ohne Trypsin-Zusatz f{\"a}hig, l{\"o}ste aber nach der Infektion von H{\"u}hnern nur eine zeitlich begrenzte Erkrankung aus. Des Weiteren wurde die HA-Reassortante TG05-HAR65 generiert, deren Genom aus dem HA-Gen des HPAIV-Isolates A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) und den anderen sieben Gensegmenten von TG05 besteht. Dieses Virus konnte in-vitro ebenfalls Trypsin-unabh{\"a}ngig replizieren, f{\"u}hrte aber zu einer Letalit{\"a}t von 30\%. Eine weitere Reassortante, R65-HATG05poly, enthielt die umgekehrte Genkonstellation: das mutierte TG05-HA und die anderen Gensegmente des R65. An der Infektion verstarben acht von zehn H{\"u}hnern, was der Letalit{\"a}t von „nat{\"u}rlichen“ HPAIV entspricht. Der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle ist daher ein notwendiger, aber nicht hinreichender Schritt in der Evolution von LPAIV zu HPAIV. So kann nicht jeder H5- oder H7-LPAIV-Stamm als unmittelbarer HPAIV-Vorl{\"a}ufer dienen. Zus{\"a}tzlich zur HA-Spaltstelle sind weitere Virulenz-Determinanten im HA selbst, aber auch in den anderen viralen Proteinen, vorhanden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher auch der Einfluss der Aminos{\"a}uren der unmittelbaren Spaltstellen-Umgebung untersucht. Dazu wurden verschiedene Virus-Mutanten des R65 mit Aminos{\"a}ure-Substitutionen in der HA-Spaltstelle selbst (Motive ETR und ER) und in ihrer direkten Umgebung (HA-S346V) generiert und hinsichtlich der in-vitro-Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HA-346S einen Vorteil f{\"u}r die Replikation von LPAIV und HPAIV vermittelt. T an Position 2 der Spaltstelle unterst{\"u}tzt die Replikation von LPAIV. Bei Erwerb der polybasischen Spaltstelle w{\"a}hrend der Evolution von LPAIV zu HPAIV m{\"u}ssen also auch die benachbarten Regionen im HA angepasst werden. Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich {\"u}ber infizierte V{\"o}gel von S{\"u}dostasien nach Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von S{\"a}ugerspezies. Normalerweise weisen avi{\"a}re Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K, was sonst in humanen St{\"a}mmen zu finden ist. Um im dritten Teil dieser Arbeit den Einfluss dieser Mutation auf das breite Wirtspektrum der Clade 2.2-Viren zu untersuchen, wurde im HPAIV-Isolat R65 PB2-627K durch E ersetzt und die Virusmutante R65-PB2K627E generiert. Im Vergleich zu R65 war die Replikation von R65-PB2K627E in S{\"a}ugerzellen drastisch reduziert, in Vogelzellen replizierten beide Viren jedoch gleich. Des Weiteren f{\"u}hrte die Substitution zu einer extrem verringerten Polymerase-Aktivit{\"a}t auf 5\% in S{\"a}ugerzellen, aber nur zu einer vergleichsweise wenig verringerten Aktivit{\"a}t in Vogelzellen. W{\"a}hrend die Virulenz im Huhn durch die Mutation nicht ver{\"a}ndert wurde, konnte bei der Bestimmung der LD50 in der Maus eine drastische Attenuierung gezeigt werden. Interessanterweise revertierte bereits nach einer Mauspassage PB2-K627E zur{\"u}ck zu K, im Huhn erfolgte diese Reversion aber nicht. Um zu untersuchen, ob andere virale Proteine f{\"u}r diese Reversion notwendig sind, wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder mehrere Gensegmente des R65 im Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1) tragen, welches nat{\"u}rlicherweise PB2-627E besitzt. Mittels Zellkultur-Passagen dieser Reassortanten konnte gezeigt werden, dass die Reversion zu PB2-627K nur in S{\"a}ugerzellen auftritt, und dass dazu das Nukleoprotein des R65 notwendig ist. Die schnelle Reversion zu PB2-627K in S{\"a}ugerzellen und in M{\"a}usen zeigt, dass die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 in ihrer Evolution m{\"o}glicherweise mehrere Wirte gehabt haben, zu denen wahrscheinlich auch S{\"a}uger geh{\"o}rten.},
  language  = {de}
}