@phdthesis{Bieler2012,
  author    = {Sven Bieler},
  title     = {Funktionelle Analyse der prim{\"a}ren Stressantwort humaner Endothelzellen (Huvec) auf Proteasominhibitoren im kardiovaskul{\"a}ren System},
  journal    = {Functional analysis of the primary stress response of endothelial cells (Huvec) to proteasome inhibition in a cardiovascular system},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001273-1},
  year      = {2012},
  abstract  = {Zusammenfassung Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist das wichtigste nicht-lysosomale proteolytische System f{\"u}r den Abbau intrazellul{\"a}rer Proteine. Die Inhibition des UPS kann dosisabh{\"a}ngig den apoptotischen Zelltod oder die Induktion einer protektiven Stressantwort ausl{\"o}sen. In der therapeutischen Anwendung der Proteasominhibition sind neben der Wirksamkeit auch exakte Kenntnisse der Wirkungsweise essentiell, um die prim{\"a}ren Effekte durch die Proteasominhibition besser zu erfassen und die initialen Effekte der Vermittlung dieser zellul{\"a}ren Reaktion besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurden Methoden der Proteom- und Transkriptomebene kombiniert, um komplexe zellul{\"a}re Ver{\"a}nderungen von Endothelzellen nach Proteasomhemmung zu charakterisieren. Weiterhin wurde mittels Immunpr{\"a}zipitation Ubiquitin-bindender Proteine untersucht, welche Substrate des Proteasoms nach Proteasomhemmung in Endothelzellen stabilisiert werden. Prim{\"a}re humane Endothelzellen (Huvec) wurden als Modell gew{\"a}hlt und mit niedrigen bzw. hohen Dosierungen des Proteasominhibitors MG132 behandelt. Das Expressionsprofil wurde in einer Zeitkinetik innerhalb der ersten 6h mittels Affymetrix Chipanalysen bestimmt. Die differentielle Proteinexpression nach zwei Stunden Proteasomhemmung wurde im Gesamtzelllysat durch 2D Gelelektrophorese und anschlie{\"s}ende Silberf{\"a}rbung visualisiert. Dabei konnten mehr als 20 regulierte Proteine identifiziert werden, welche zuvor nicht direkt im Zusammenhang mit der Vermittlung einer protektiven Stressantwort nach niedrig dosierter Proteasomhemmung bekannt waren. Durch Korrelation mit den parallel durchgef{\"u}hrten Expressionsarrays konnte die Regulation dieser Proteine als unabh{\"a}ngig von der Transkription erfasst werden. Die funktionelle Annotation der Daten zeigte dabei eine Anreicherung von Proteinen der zellul{\"a}ren Stressantwort, der intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion und des oxidativen Stresses. Diese waren differentiell reguliert nach niedrig bzw. hoch dosierter Proteasominhibition. W{\"a}hrend die niedrig dosierte Proteasominhibition ein protektives Genmuster zeigte, induzierten hohe Dosen den apoptotischen Zelltod. Auch konnte, in Abh{\"a}ngigkeit vom Grad der Proteasominhibition, ein deutlicher Anstieg der freien Radikale innerhalb der Zellen nachgewiesen werden, was auf die Vermittlung der Apoptose durch freie Radikale hinweist. Mit DJ-1, Peroxiredoxin-1 und -6 wurden mehrere Sensorproteine f{\"u}r oxidativen Stress identifiziert. Um, neben der Proteom- und Transkriptomanalyse, auch gezielt Substrate der Proteasominhibition zu identifizieren und als m{\"o}gliche Mediatoren der protektiven Stressantwort zu identifizieren, wurden Gesamtzelllysate mittels Ubiquitin-Immunpr{\"a}zipitation getrennt und Ubiquitin-bindende Proteine per Massenspektrometrie identifiziert. Dabei konnte ein Set von 22 Proteinen identifiziert werden, welche spezifisch nach 2h an der Ubiquitin-spezifischen Matrix gebunden wurden. In diesem Set finden sich vor allem RNA bindende Proteine, Bestandteile des UPS und ribosomale Proteine. Um gezielt transkriptionelle Mediatoren der protektiven Stressantwort nach partieller Proteasominhibition zu identifizieren, wurde eine Subproteom-Analyse mit nukle{\"a}ren Extrakten von Huvec durchgef{\"u}hrt. Nach Visualisierung mittels DIGE-Labeling und quantitativer Auswertung konnten 361 regulierte Spots nach 2 st{\"u}ndiger Proteasominhibition erfasst werden. Von diesen Spots konnten 319 per MALDI-MS identifiziert werden und 152 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden. Die funktionelle Auswertung ergab eine deutliche {\"U}berrepr{\"a}sentation von RNA-bindenden und Splicing-relevanten Proteinen. Auch konnte f{\"u}r HnRNP A1, einem RNA-bindenden Protein, eine funktionelle Methylierung sowie eine Ver{\"a}nderung der subzellul{\"a}ren Lokalisierung nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Regulation des zellul{\"a}ren Splicings hin. In parallel dazu angefertigten Exon-sensitiven Affymetrix Arrays wurden {\"u}ber 600 Gene mit differentiell regulierten Exons identifiziert, welche vor allem Gene mit Rezeptor- und Transportproteinen kodieren. Auch eine erh{\"o}hte Anzahl von Genen mit Methyltransferase-/Kinaseaktivit{\"a}t wurde identifiziert. Insbesondere die Methyltransferasen, welche auch bei der posttranslationalen Modifikation von HnRNP A1 eine Rolle spielen, zeigten dabei eine signifikante Regulation unter niedrig dosierter Proteasominhibition. Zusammengefasst tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse dazu bei, einen detaillierten {\"U}berblick {\"u}ber die initialen Prozesse niedrig dosierter Proteasominhibition in Endothelzellen zu geben. Die Daten deuten dabei auf eine schnelle Adaptation der Zellen nach partieller Proteasomhemmung mittels Aktivierung einer anti-oxidativen Stressantwort sowie durch Regulation von Splicingvorg{\"a}ngen hin, die letztendlich in einem ver{\"a}nderten Expressionsprofil der Endothelzellen m{\"u}nden. Mit diesem systematischen Ansatz und der Kombination von Proteom- und Transkriptomanalyse konnten dabei einzelne Targets f{\"u}r die Mediation einer protektiven zellul{\"a}ren Stressantwort nach partieller Proteasomhemmung identifiziert werden.},
  language  = {de}
}