@phdthesis{Hagen2018,
  author    = {Paul Hagen},
  title     = {Charakterisierung von Struktur und Funktionsmechanismus des Organo-Anionen-Transporters 2B1 (OATP2B1) mittels F{\"o}rster-Resonanzenergietransfers},
  journal    = {Characterisation of structure and mechanism of action of the organic anion-transporting polypeptide 2B1 (OATP2B1) using F{\"o}rster resonance energy transfer},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-24428},
  pages     = {149},
  year      = {2018},
  abstract  = {Der Transport von Substanzen innerhalb eines Organismus stellt eine wesentliche Vorausset-zung zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen dar. Neben endogenen Stoffen unter-liegen auch die meisten exogenen Substanzen zahlreichen Transportvorg{\"a}ngen, darunter auch die meisten Arzneistoffe. Deren Pharmakokinetik wird oft entscheidend von ihrer Affini-t{\"a}t zu bestimmten Transportproteinen beeinflusst. Von diesen pr{\"a}sentiert neben den ABC-Transportern die Familie der SLC-Transporter das gr{\"o}{\"s}te Spektrum einzelner Vertreter. Auf-grund ihrer Beteiligung sowohl an physiologischen als auch pharmakokinetischen Prozessen erweisen sich darunter die OATPs als besonders interessant. Obwohl deren Bedeutung am Stofftransport durch umfassende Charakterisierung ihrer Expression und Funktion unbestrit-ten ist, erweist sich ihr zugrundeliegender Transportmechanismus noch immer als nicht voll-st{\"a}ndig verstanden. Jedoch bieten Untersuchungen an verwandten Transportern, wie der bak-teriellen Lactose-Permease, Erkenntnisse, die sich m{\"o}glicherweise auch auf die OATPs {\"u}ber-tragen lassen. F{\"u}r diese wurde ein Rocker-switch-Mechanismus vorausgesagt, bei dem die Bindung des Substrats zu einer Konformations{\"a}nderung f{\"u}hrt. Hierdurch wird das Substrat entlang einer zentralen Pore durch das Transportprotein bef{\"o}rdert. Eine M{\"o}glichkeit derartige Konformations{\"a}nderungen, die mit einer Verschiebung der Abst{\"a}nde innerhalb des Molek{\"u}ls einhergehen, zu untersuchen, stellt der F{\"o}rster-Resonanzenergietransfer (FRET) dar. Dieser beschreibt die strahlungslose Energie{\"u}bertragung zwischen zwei Chromophoren, deren Effizi-enz mit dem Abstand der Chromophore zu- bzw. abnimmt. Erstes Ziel dieser Arbeit war es OATP2B1, als einen Vertreter der OATPs, so zu modifizieren, dass er f{\"u}r die Untersuchung mittels FRET zug{\"a}nglich werden w{\"u}rde. Dies erfolgte durch die Herstellung von OATP2B1-Fusionsproteinen, bei denen der Transporter mit den FRET-geeig-neten Fluorophoren ECFP/EYFP bzw. ECFP/FlAsH ausgestattet wurde. Die Integration des ECFP erfolgte dabei jeweils am C-Terminus, w{\"a}hrend EYFP und FlAsH jeweils in die intrazellul{\"a}ren Schleifen des Proteins eingebracht wurden. Im Weiteren galt es, diese Fusionsproteine hin-sichtlich ihrer Funktion (Transport radioaktiv-markierter Substrate) und Lokalisation in der Zelle (Mikroskopie) zu charakterisieren. Hierbei wurde gezeigt, dass lediglich die Modifikation mit FlAsH in der dritten intrazellul{\"a}ren Schleife zu keiner Funktionsbeeinflussung f{\"u}hrte und dieses Fusionsprotein auch als einziges eine membran{\"a}re Lokalisation aufwies. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der Messung der FRET-Effizienzen der Fusionsproteine mithilfe konfoka-ler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei konnte zun{\"a}chst bei allen Fusionsproteinen ein FRET-Signal erfasst werden, das in Abh{\"a}ngigkeit der Position des FRET-Partners in der intrazellul{\"a}-ren Schleife eine unterschiedliche Effizienz aufwies. Die FRET-basierte Berechnung der Ab-st{\"a}nde innerhalb des Molek{\"u}ls brachte Ergebnisse hervor, die vergleichbar mit denen waren, die anhand von Kristallstrukturanalysen verwandter Transporter erhoben wurden. Teilweise {\"U}bereinstimmungen ergaben sich daneben auch beim Vergleich der berechneten Abst{\"a}nde mit denen computergest{\"u}tzter Modelle. Die Ergebnisse zeigen damit das Potenzial dieser Me-thode, die Struktur des OATP2B1 aufzukl{\"a}ren. Au{\"s}erdem st{\"u}tzen sie zum Teil die prognosti-zierte Strukturverwandtschaft der OATPs zu der strukturell besser charakterisierten Lactose-Permease. Letztes Ziel war es zu untersuchen, ob sich die gemessenen FRET-Effizienzen durch Zugabe des OATP2B1-Substrats E1S beeinflussen lie{\"s}en. Es konnte f{\"u}r fast alle Fusionsproteine eine Beeinflussung festgestellt werden, wobei die FRET-Effizienzen in Abh{\"a}ngigkeit von der Position des FRET-Partners sowohl ab- als auch zunahmen. Daneben zeigte auch die Zugabe des OATP2B1-Inhibitors Rifampicin eine verschieden ausgepr{\"a}gte Beeinflussung. Die Zugabe des Nicht-OATP2B1-Substrats 17β-Estradiol-3-glucuronid f{\"u}hrte zu keiner Beeinflussung. Die Ergebnisse zeigen damit eine substanzspezifische Beeinflussung des Fusionsproteins. Die be-rechneten {\"A}nderungen des Abstandes waren vergleichbar mit den aus Kristallstrukturanaly-sen gewonnenen Abst{\"a}nden der Lactose-Permease. Es konnten hierdurch erste Hinweise ge-liefert werden, dass der dem OATP2B1 zugrundeliegende Transportmechanismus einem {\"a}hn-lichen Prinzip folgt, wie es f{\"u}r den Rocker-Switch beschrieben wurde. Die Bindung und der Transport des Substrats an das OATP2B1 f{\"u}hren zu einer Abstands{\"a}nderung innerhalb des Molek{\"u}ls, die sich am ehesten {\"u}ber eine Konformations{\"a}nderung erkl{\"a}ren lie{\"s}e. Diese Arbeit kann insgesamt erste Grundlagen zur weiteren Charakterisierung der Struktur und des Transportmechanismus der OATPs liefern. Sie zeigt, dass die Herstellung eines funk-tionsf{\"a}higen FRET-Fusionsproteins m{\"o}glich ist und dass deren Untersuchung nachvollziehbare Ergebnisse liefern kann. Au{\"s}erdem bietet sie einen Ansatz, FRET-basierte Screening-Verfah-ren f{\"u}r Transportersubstrate zu etablieren. Inwieweit diese praktisch umzusetzen sind, muss jedoch durch aufbauende Arbeiten gekl{\"a}rt werden.},
  language  = {de}
}