@phdthesis{Baesell2013,
  author    = {Katrin B{\"a}sell},
  title     = {Globale Phosphoproteomanalyse Gram-positiver Bakterien unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung regulatorischer Mechanismen},
  journal    = {Global phosphoproteome analysis of Gram-positive bacteria with particular regard to regulatory mechanisms},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001463-5},
  year      = {2013},
  abstract  = {Die Analyse bakterieller Phosphoproteome r{\"u}ckt durch die Einflussnahme von Phosphorylierungsereignissen im Virulenzgeschehen pathogener Mikroorganismen immer weiter in den Vordergrund. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der globalen Analyse bakterieller Phosphoproteome unter Anwendung verschiedener Techniken der Proteomforschung. Ziel war es, einen m{\"o}glichst umfassenden {\"U}berblick {\"u}ber das cytosolische Phosphoproteom zu gewinnen, die Dynamik der Protein-Phosphorylierungen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu analysieren und daraus folgend Hinweise auf regulatorische Mechanismen zu erhalten. Im Zuge der Untersuchungen zum Phosphoproteom von Bacillus subtilis wurde das auf den phosphosensitiven Pro-Q® Diamond-Farbstoff basierende 2D-Gel-F{\"a}rbeprotokoll optimiert und validiert. Ferner wurde dieses Protokoll erfolgreich f{\"u}r die Untersuchungen des Phosphoproteoms von Mycoplasma pneumoniae und Staphylococcus aureus eingesetzt. Durch die Etablierung einer Methode zur Phosphopeptidanreicherung konnte der Blick auf das Gesamtphosphoproteom von S. aureus komplementiert werden. Insgesamt war es dadurch m{\"o}glich, 103 phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene Phosphorylierungsstellen von S. aureus zu identifizieren, darunter z. B. den Virulenzregulator SarA, dessen Phosphorylierung einen Hinweis auf seine m{\"o}gliche Regulation aufzeigt. Zus{\"a}tzlich konnten die Phosphorylierungsergebnisse der Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase erste Hinweise auf eine Regulation der Substratbindung liefern und einen Erkl{\"a}rungsansatz enstehen lassen, der die Wirkungslosigkeit einiger in der Literatur beschriebenen Enzyminhibitoren (potentielle antimikrobielle Wirkstoffe) in in vivo Studien darlegt. In einem auf der Pro-Q® Diamond-F{\"a}rbung beruhenden Quantifizierungsansatz konnten 10 signifikante Ver{\"a}nderungen in der Signalintensit{\"a}t der phosphorylierten Proteine unter Glukosehunger, nitrosativem, oxidativem und osmotischem Stress festgestellt werden. Diese liefern erste Indizien auf durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerte Regulationsmechanismen. Besonders die unter nitrosativen Stress neu auftretenden putativ phosphorylierten Proteinspots der Proteine FdaB (Fruktose-Bisphosphataldolase) und HchA (molekulares Chaperon Hsp31/Glyoxalase 3) lassen Spekulationen {\"u}ber neue Stoffwechselwege, wie z. B. einen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus, zu. Dar{\"u}ber hinaus konnten durch die Glukosehungerexperimente und die Spezifizierung der Phosphorylierungsstelle T537 der Pyruvatkinase von S. aureus ein Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden, der das \"Finetuning\" des Energieladungszustandes der Zelle {\"u}ber einen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus beschreibt. Von weiterem Interesse war die Identifizierung von am Arginin phosphorylierten Peptiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierf{\"u}r das Phosphopeptid-anreicherungsprotokoll optimiert, so dass in Zusammenarbeit mit A. Elsholz (Inst. f. Mikrobiologie, EMAU Greifswald) die Identifizierung von phosphorylierten Argininresten der Argininkinase McsB und der ATPase ClpC in B. subtilis m{\"o}glich wurde. Dar{\"u}ber hinaus wurde die Methode in globalen Untersuchungen einer Phosphatasemutante (∆ywlE, B. subtilis) angewandt. Mittels der im Rahmen dieser Arbeit durchgef{\"u}hrten massenspektrometrischen Analyse der angereicherten Peptide konnten 111 Arginin-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Zur Verbesserung der Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen in B. subtilis wurde ein Protokoll entwickelt, indem das Auftrennungspotential des 2D-Gels, die Identifizierung phosphorylierter Proteine anhand des Pro-Q® Diamond-Farbstoffs und die auf die metabolische Markierung beruhende Quantifizierung miteinander kombiniert wurde. Im Ergebnis konnte anhand dieser Methode eine bessere Reproduzierbarkeit und eine h{\"o}here Sensitivit{\"a}t bei geringeren Ver{\"a}nderungen im Vergleich zu dem Pro Q® Diamond basierten Quantifizierungsansatz erzielt werden.},
  language  = {de}
}