@phdthesis{Wessels2016,
  author    = {Ute Wessels},
  title     = {Identifizierung von Virulenzfaktoren avi{\"a}rer und porziner Influenzaviren mittels reverser Genetik in relevanten Tiermodellen},
  journal    = {Identification of Virulence Determinants of Avian and Porcine Influenza Viruses by Reverse Genetics in Relevant Animal Hosts},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002424-6},
  year      = {2016},
  abstract  = {Die reverse Genetik ist ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung und Impfstoffentwicklung der Influenza-A- und -B-Viren. Oft ist der limitierende Schritt f{\"u}r die Erstellung eines solchen Systems der reversen Genetik, bestehend aus mehreren Plasmiden f{\"u}r die einzelnen Gensegmente, die Klonierung der Virusgene in den Expressionsvektor. F{\"u}r eine schnellere und einfachere Klonierung wurde in dieser Arbeit das LacZa-Fragment mittels modifizierter QuikChange-Reaktion in den Klonierungsvektor pHWSccdB inseriert. Mit dem so entstandenen Vektor pHWSccdBLacZa ist es nun m{\"o}glich, zus{\"a}tzlich eine Blau/Wei{\"s}-Selektion durchzuf{\"u}hren. Beider target-primed plasmid amplification zur Insertion des viralen Gensegmentes werden hierbei die beiden Selektionsmarker ccdB und LacZa durch das virale Gen ersetzt. Bakterienkolonien mit kloniertem Gensegment k{\"o}nnen von denen ohne komplettes Insert nun leichter und fr{\"u}hzeitiger durch eine nicht vorhandene Blauf{\"a}rbung unterschieden werden. Schweine spielen in der Influenzavirus-Transmission eine besondere Rolle, da sie als sog. „mixing vessel“ gelten. Sie k{\"o}nnen z. B. Reassortanten aus avi{\"a}ren und porzinen Influenzaviren auf den Menschen {\"u}bertragen, die sich bei einer zeitgleichen Infektion mit beiden Viren im Schwein bilden k{\"o}nnen. In dieser Arbeit wurden die seit 1979 in Europa zirkulierenden avi{\"a}ren H1N1- Schweineviren betrachtet. Sie sind Schweinest{\"a}mme, deren Gene von einem avi{\"a}ren Vorl{\"a}ufervirus abstammen. Unter dem Ziel der Untersuchung der molekularen Determinanten des Wirts-Tropismus dieser avi{\"a}ren H1N1-Schweineviren wurden Reassortanten und Zufallsressortanten hergestellt unter Verwendung des avi{\"a}ren Virus A/Duck/Bavaria/1/77 (H1N1) (DkBav) und des avi{\"a}ren Schweinevirus A/Swine/Belgium/1/79 (H1N1) (SwBelg). Zun{\"a}chst wurde die Replikationseffizienz von DkBav, SwBelg und den hergestellten Reassortanten auf einer avi{\"a}ren und einer porzinen Zelllinie untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass f{\"u}r das avi{\"a}re Virus DkBav das HA von SwBelg ausreicht, um in porzinen Zellen das Wachstumsniveau von SwBelg zu erreichen. Das HA-Segment ist also entscheidend f{\"u}r den Wirtstropismus von DkBav in einer porzinen Zelllinie. Experimente im Schwein zeigten jedoch, dass DkBav nicht alleine durch das HA von SwBelg zu einem Schweinevirus wird. F{\"u}r diese Experimente wurden Schweine intranasal mit den hergestellten Viren, SwBelg und DkBav infiziert. Um die Replikation im Schwein zu steigern, ben{\"o}tigt DkBav zus{\"a}tzlich zum HA noch das NA von SwBelg und f{\"u}r die Transmission von Schwein zu Schwein das NP sowie eines oder mehrere der anderen Gensegmente von SwBelg. F{\"u}r eine starke Virusvermehrung in der Lunge ben{\"o}tigt DkBav den Polymerasekomplex, HA und NA von SwBelg. F{\"u}r die Transformation in ein Schweinevirus ben{\"o}tigt DkBav also kein bestimmtes Gensegment, sondern eine Kombination mehrerer Gensegmente. F{\"u}r hochpathogene avi{\"a}re Influenzaviren ist die polybasische Spaltstelle des Oberfl{\"a}chenproteins HA der wichtigste Virulenzfaktor. Das HA ist u. a. f{\"u}r die Bindung und die Fusion der Endosomenmembran von Influenzaviren mit der Wirtszelle zust{\"a}ndig. Da eine polybasische HA-Spaltstelle alleine jedoch nicht ausreicht, um die Virulenz eines LPAIV deutlich zu erh{\"o}hen, wurde in dieser Arbeit nach weiteren Virulenzdeterminanten im HA des hochpathogenen Influenzavirus A/Swan/Germany/R65/2006 (H5N1) (R65wt) zus{\"a}tzlich zur polybasischen Spaltstelle gesucht. Hierzu wurden von den Viren R65wt und A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) mit eingesetzter polybasischer Spaltstelle (TG05poly) verschiedene HA-Chim{\"a}ren und -Mutanten hergestellt und diese in vitro und in vivo untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die eingef{\"u}gten Mutationen nicht ausreichten, um TG05poly zu einem hochpathogenen Virus zu machen. F{\"u}r das hochpathogene Virus R65wt wurden die Aminos{\"a}uren HA-R123 und HAI124 als weitere Virulenzdeterminanten identifiziert. Bei HA-Sequenz- und HAStrukturanalysen wurde festgestellt, dass die Aminos{\"a}uren HA-123 und HA-124 innerhalb des niedrigpathogenen bzw. des hochpathogenen Ph{\"a}notyps hoch konserviert vorliegen. Mutationen an diesen Positionen verringern nicht nur HA-Aktivierungs-pH und Virus-Inaktivierungs-pH deutlich, sondern auch die Letalit{\"a}t des Virus um fast 50 \% (HA-I124T) oder das Virus wurde sogar avirulent (HA-R123S). Im Falle einer polybasischen Spaltstelle ist also eine erh{\"o}hte pH-Stabilit{\"a}t des HA vermittelt durch die Aminos{\"a}ure R123 essentiell f{\"u}r die Entstehung eines hochpathogenen avi{\"a}ren H5N1-Virus aus einem niedrigpathogenen Vorl{\"a}ufer.},
  language  = {de}
}