@phdthesis{TrautweinSchult2013, author = {Anke Trautwein-Schult}, title = {Purinarme Lebensmittel – Enzymatische Reduktion von Purinen in Lebensmitteln}, journal = {Low purine food – enzymatic reduction of purines in food}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001652-4}, year = {2013}, abstract = {Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Senkung der Harns{\"a}urekonzentration im Blutserum von Patienten mit Hyperurik{\"a}mie und der damit verbundenen Verringerung der Anzahl von schmerzhaften Gichtanf{\"a}llen. Daf{\"u}r sollten Purine in Lebensmitteln mit einem Gemisch aus purinabbauenden Enzymen zu dem gut l{\"o}slichen Allantoin abgebaut werden. Durch diesen neuen Ansatz ist eine abwechslungsreiche Ern{\"a}hrung von Hyperurik{\"a}miepatienten ohne oder mit reduzierter zus{\"a}tzlicher medikament{\"o}ser Behandlung zur Senkung der Harns{\"a}urebildung, Erh{\"o}hung der Harns{\"a}ureausscheidung bzw. enzymatischen Reduktion von Harns{\"a}ure m{\"o}glich. Die Analyse des Wachstumsverhaltens von Arxula adeninivorans LS3 zeigte die Vermehrung des Zellmaterials in einer Kultivierung mit Adenin als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bzw. mit Hypoxanthin und Harns{\"a}ure als alleiniger Stickstoffquelle. Die F{\"a}higkeit des Wachstums mit Adenin, Hypoxanthin oder Harns{\"a}ure als alleiniger Stickstoffquelle best{\"a}tigte das Vorhandensein des Purinabbauweges in der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans LS3. Das Guanin-Deaminase-Gen (AGDA) aus A. adeninivorans LS3 kodierte f{\"u}r ein Protein aus 475 Aminos{\"a}uren, das in der Zelle als Dimer vorlag (55 kDa je Untereinheit). Das Guanin-Deaminase-Protein (Agdap) zeigte eine Homologie auf Aminos{\"a}ureebene zwischen 44 und 55 \% zu anderen pilzlichen Guanin-Deaminasen. Beim Wachstum auf Medien mit Adenin, Hypoxanthin oder Guanin als alleiniger Stickstoffquelle erfolgten eine Induktion der Genexpression des AGDA-Gens sowie eine intrazellul{\"a}re Akkumulation des Guanin-Deaminase-Proteins in der Vakuole wie auch dem Zytoplasma der Hefezelle. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die biochemische Charakterisierung der Uratoxidase. Das Uratoxidase-Gen (AUOX) aus A. adeninivorans LS3 lag auf Chromosom 4 und kodierte f{\"u}r das Uratoxidase-Protein (Auoxp) mit 306 Aminos{\"a}uren. Bei dem Auoxp handelte es sich um ein 35 kDa gro{\"s}es Protein, das als Dimer in der Zelle vorlag. Ein Vergleich mit anderen pilzlichen Uratoxidasen ergab eine Homologie von 61 bis 65 \% auf der Ebene der Aminos{\"a}uresequenz. Das Enzym zeigte konservierte Sequenzmotive, die in den Uratoxidasen einer Vielzahl von Organismen beschrieben wurden. Die AUOX-mRNA-Konzentration stieg bei Wachstum auf Medien mit Harns{\"a}ure, Adenin und Hypoxanthin als alleiniger Stickstoffquelle. Die Akkumulation von Auoxp zeigte einen Maximalwert nach achtst{\"u}ndiger Kultivierung im Medium mit Harns{\"a}ure und zeitlich verschoben mit den Stickstoffquellen Adenin bzw. Hypoxanthin (nach 12 Stunden). Der biotechnologische Einsatz der purinabbauenden Enzyme der Hefe A. adeninivorans erforderte eine {\"U}berexpression der Uratoxidase- bzw. der Guanin-Deaminase-Gene in transgenen A. adeninivorans-St{\"a}mmen aufgrund zu niedriger, nat{\"u}rlicher Expressionsh{\"o}he im Wildtypstamm LS3. Als Transformations-/Expressionssystem fand das etablierte Xplor®2-Vektorsystem Verwendung. Diese Plattform bietet den Vorteil, dass keine Resistenzgene in die Hefe {\"u}bertragen werden. Die Hefen wurden mit unterschiedlichen Expressionsmodulen transformiert, um die optimalen Expressionsbedingungen f{\"u}r die Guanin-Deaminase bzw. die Uratoxidase zu ermitteln. Vergleichende Untersuchungen bez{\"u}glich der Integrationsh{\"a}ufigkeit, dem Wirtsorganismus (homolog/heterolog) und der optimalen Expression (konstitutiv/induziert) zeigten, dass A. adeninivorans ein geeigneter Organismus f{\"u}r die Expression des Guanin-Deaminase- bzw. Uratoxidase-Gens darstellte. F{\"u}r weiterf{\"u}hrende Analysen erfolgte die n{\"a}here Untersuchung der Hefetransformanden mit der h{\"o}chsten Guanin-Deaminase-Aktivit{\"a}t bzw. der {\"u}ber einen l{\"a}ngeren Zeitraum konstant hohen Uratoxidase-Aktivit{\"a}t. Das {\"u}ber den C-terminalen His-Tag gereinigte rekombinante Protein zeigte eine hohe {\"U}bereinstimmung der biochemischen Eigenschaften (Substratspektrum, intrazellul{\"a}re Lokalisation, usw.) im Vergleich zum endogenen Protein der Hefe A. adeninivorans LS3 (nach induzierter Genexpression). Die rekombinanten Enzyme des Purinabbauweges (Uratoxidase, Guanin-Deaminase, Adenin-Deaminase und Xanthin-Oxidoreduktase) bewirkten nach deren Zugabe zu einem reinen Puringemisch aus Adenin, Guanin, Xanthin, Hypoxanthin und Harns{\"a}ure eine Reduktion der Konzentration s{\"a}mtlicher Purine. Das Gemisch aus purinabbauenden Enzymen der Hefe A. adeninivorans belegte bei ersten Anwendungen in einem Lebensmittel (Rinderbr{\"u}he) die abbauende Wirkung auf s{\"a}mtliche, im Lebensmittel befindlichen, Purine. Es gelang in dieser Arbeit, den Puringehalt eines Lebensmittels mit in transgenen A. adeninivorans-St{\"a}mmen hergestellten Proteinen enzymatisch abzubauen.}, language = {de} }