@phdthesis{Hundt2011,
  author    = {Jana Hundt},
  title     = {Molekulare Mechanismen der Adaptation sowie Impfstudien zur Bek{\"a}mpfung von avi{\"a}ren Influenza-A-Viren},
  journal    = {Molecular mechanisms of adaptation and vaccine studies to control avian influenza A viruses},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000994-1},
  year      = {2011},
  abstract  = {Wildv{\"o}gel stellen die nat{\"u}rlichen Wirte und das Hauptreservoir f{\"u}r Influenza-A-Viren dar. Einige Influenza-St{\"a}mme konnten sich zudem an verschiedene S{\"a}ugetierarten wie Mensch, Schwein oder Pferd anpassen. Die molekularen Mechanismen der Adaptation von Influenza-A-Viren an einen neuen Wirt sind komplex. Sie werden u. a. auf eine modifizierte Interaktion viraler Proteine mit Wirtszellproteinen zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, die in Verbindung mit dem Auftreten von Punktmutationen in viralen Proteinen, vor allem den Polymeraseproteinen, steht und zu einer optimierten Replikation von Influenza-A-Viren im neuen Wirt f{\"u}hren kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden molekulare Werkzeuge entwickelt, die der Identifizierung wirtsspezifischer Interaktionspartner der viralen Ribonukleoprotein-Komplexe (vRNP) dienen k{\"o}nnen. Dazu wurden mittels reverser Genetik rekombinante Influenza-A-Viren unterschiedlichen Wirtsspektrums mit einem Strep-tag als Markierung am C-Terminus der Polymerase-Untereinheit PB2 generiert. Zu den verwendeten Viren z{\"a}hlten das humane A/HongKong/1/68 (H3N2), die beiden spezies{\"u}bergreifenden Viren A/swan/Germany/R65/06 (H5N1) (‚R65‘) sowie A/seal/Massachusetts/1/80 (H7N7) und das avi{\"a}re A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8). Durch Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen wurde die stabile Expression des Strep-PB2-Fusionsproteins in infizierten Zellen best{\"a}tigt. Es wurde zudem gezeigt, dass die markierten Viren auf S{\"a}uger- und Vogelzellen vergleichbar mit den entsprechenden unmarkierten Viren replizieren. Anhand des Strep-getaggten PB2-Proteins des R65-Virus wurden erfolgreich virale RNP-Komple xe aus infizierten S{\"a}uger- und Vogel-Zellen mittels Affinit{\"a}tschromatographie aufgereinigt und deren vier Protein-Bestandteile PB2, PB1, PA und NP durch MALDI-tof-Massenspektrometrie identifiziert. Die Palette getaggter Viren bildet die Grundlage f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Studien zur Untersuchung Virus-Wirt-spezifischer Wechselwirkungen, die f{\"u}r den Wirtswechsel und die Adaptation von Influenza-A-Viren entscheidend sein k{\"o}nnen. Die Entstehung des pandemischen Influenza-Virus A/HongKong/1/68 (H3N2) (‚Hk68‘) geht auf ein Reassortment zwischen dem zuvor zirkulierenden humanen H2N2-Virus und einem avi{\"a}ren H3-Stamm zur{\"u}ck. Hierbei wurden die Segmente des humanen Virus, die f{\"u}r das Rezeptor-bindende Protein Haemagglutinin (HA) und die Polymerase-Untereinheit PB1 kodieren, gegen die entsprechenden Segmente des avi{\"a}ren H3-Virus ausgetauscht. Bei einem Sequenzvergleich zwischen dem Hk68-PB1 und dem PB1 des dem unbekannten avi{\"a}ren Donor nahestehenden Isolates A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (‚dUk‘) wurden lediglich sechs Unterschiede in der Aminos{\"a}uresequenz identifiziert, die m{\"o}glicherweise Folge der Adaptation des Hk68-Virus an den humanen Wirt sind. Nach dem Einf{\"u}gen der einzelnen Mutationen in das dUk-PB1 wurden homologe RNP-Komplexe (PB2, PB1 und PA sowie NP von Hk68) und heterologe RNP-Komplexe (PB2, PA, NP von Hk68 und PB1 bzw. PB1-Punktmutante von dUk) in transfizierten S{\"a}ugerzellen rekonstituiert. Mit Hil fe eines Luciferase-Reportertests konnte gezeigt werden, dass der heterologe Hk68/dUk-PB1-Komplex im Vergleich zum homologen Hk68-Komplex eine um 50\% erniedrigte Polymerase-Aktivit{\"a}t aufweist. Dieser negative Effekt konnte durch das Einf{\"u}gen der Mutation PB1 I12V in das dUk-PB1, aber nicht durch eine der anderen f{\"u}nf Punktmutationen, vollst{\"a}ndig aufgehoben werden. Folglich k{\"o}nnte es sich bei dieser Mutation um eine adaptive Mutation handeln. Untersuchungen an in vitro rekonstituierten RNP-Komplexen anderer Viren konnten diese Theorie unterst{\"u}tzen. Wachstumskinetiken des homologen Hk68- und dUk-Virus sowie von ihnen abgeleiteter PB1-Reassortanten und PB1-Mutanten deuteten ebenfalls auf einen Einfluss von Aminos{\"a}ureposition 12 im PB1-Protein auf die Virusreplikation hin. Mit Hilfe eines ELISAs durchgef{\"u}hrte Bindungsstudien zwischen den PA-Proteinen verschiedener Influenza-A-Viren und PB1-Peptiden mit Valin oder Isoleucin an Position 12 legten zudem eine Zu- bzw. Abnahme der Af finit{\"a}t zwischen PA und PB1 als Ursache f{\"u}r die ver{\"a}nderte Polymeraseaktivit{\"a}t nahe. Hochpathogene avi{\"a}re Influenza-A-Viren (HPAIV) vom Subtyp H5 oder H7 verursachen enorme wirtschaftliche Sch{\"a}den und stellen eine potentielle Bedrohung f{\"u}r den Menschen dar. Die Entwicklung effektiver Impfstoffe ist deshalb in vielfacher Hinsicht sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels reverser Genetik eine Elastase-abh{\"a}ngige Mutante des HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1), genannt R65-E, als potentielle lebend-attenuierte Vakzine erzeugt. Dazu wurde die polybasische Spaltstelle im HA des hochpathogenen Virus gegen eine Spaltstelle f{\"u}r die in vivo kaum verf{\"u}gbare Protease Elastase ersetzt. In vitro wurde mit Hilfe von Plaquetests, Wachstumskinetiken und Western-Blot-Analysen die strikte Abh{\"a}ngigkeit der R65-E-Replikation und der R65-E-HA-Spaltung von Elastase nachgewiesen. Im Gegensatz zum R65-Wildtyp war die R65-E-Mutante in vivo aufgrund der Abwesenheit von Elastase auf einen Replikationszyklus beschr{\"a}nkt und somit hochgradig attenuiert. Insgesamt erwies sich die R65-E-Mutante im Huhn jedoch als wenig immunogen. So kam es 7 Tage nach okulonasaler Infektion von Eintagsk{\"u}ken lediglich zu einer schwachen zellul{\"a}ren Immunantwort basierend auf CD8+ zytotoxischen T-Zellen in der Milz. Eine Antik{\"o}rper-Antwort wurde nach o kulonasaler oder in ovo Infektion nur bei jeweils einem von zehn bzw. einem von sieben Tieren induziert. Das Vorhandensein H5-spezifischer Antik{\"o}rper korrelierte hierbei mit einem Schutz der Tiere gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen HPAIV R65. Gleicherma{\"s}en ging die Abwesenheit H5-spezifischer Antik{\"o}rper bei den {\"u}brigen Versuchstieren mit einem letalen Verlauf der homologen R65-Belastungsinfektion einher. Ein partieller Schutz gegen eine heterosubtypische Belastungsinfektion mit dem HPAIV R65-H9R66mutR65 sowie eine reduzierte Virusausscheidung bei einigen Tieren der Boostergruppe, die drei Wochen nach okulonasaler Infektion eine zweite Dosis R65-E erhalten hatten, deuteten auf eine R65-E-induzierte zellvermittelte Schutzwirkung hin. Es ist zu vermuten, dass die R65-E-Mutante in vivo {\"u}berattenuiert war und aus diesem Grund keine protektive Immunabwehr induzieren konnte. R65-E eignet sich daher nicht als lebend-attenuierte Gefl{\"u}gelvakzine.},
  language  = {de}
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