@phdthesis{Hoppen2010,
  author    = {Jens Hoppen},
  title     = {Vergleichende Charakterisierung der Transkriptionsaktivatoren Ino2 und Ino4 der Hefen Saccharomyces cerevisiae und Candida albicans},
  journal    = {Comparative Characterisation of Transcription Activators Ino2 and Ino4 in the Yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000867-5},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Transkription von Genen der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae wird durch ein ICRE (inositol/choline responsive element) genanntes UAS-Element aktiviert, welches durch die Phospholipid-Vorstufen Inositol und Cholin (IC) gesteuert wird. ICRE-Motive werden durch ein Heterodimer der bHLH-Proteine Ino2 und Ino4 erkannt, wobei Ino2 {\"u}ber zwei Transkriptionsaktivierungsdom{\"a}nen (TAD) die Expression vermittelt, w{\"a}hrend Ino4 dem Kernimport des Komplexes dient. Negativer Regulator ist Opi1, der mit Ino2 interagiert. SUA7 (TFIIB) wird durch die Interaktion mit Ino2 an den Promotor rekrutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen durchgef{\"u}hrt, um ein Heterodimer aus heterolog exprimiertem Ino2 und Ino4 {\"u}ber chromatographische Methoden zu reinigen. Es wurde eine affinit{\"a}tschromatographische Strategie entwickelt, die es gestattet, epitopmarkiertes Ino2 und Ino4 von einem Gro{\"s}teil der Fremdproteine abzutrennen. Mit gr{\"o}{\"s}eren Zellmengen k{\"o}nnte es k{\"u}nftig gelingen, ein Ino2/Ino4-Heterodimer zu reinigen und es nach Kristallisierung zusammen mit einem ICRE-Motiv einer R{\"o}ntgenstrukturanalyse zug{\"a}nglich zu machen. Unter Verwendung genomischer Sequenzdaten von S. cerevisiae wurden in dieser Arbeit weitere Gene identifiziert, die ICRE-Motive in ihrer Promotorregion tragen, aber keine offensichtliche Rolle bei der Phospholipidbiosynthese spielen. Untersuchungen zeigten, dass die ICRE-tragenden Gene FAR8, RSF1, YEL073C und URA8 relativ stark, die Gene ARG4, ERG20, GPD2 und VHT1 nur moderat durch IC beeinflusst werden. F{\"u}r das in S. cerevisiae stark IC-abh{\"a}ngige INO1 Gen (50-fache Derepression bei IC-Mangel) wurde gezeigt, dass drei distinkte ICRE-Motive f{\"u}r diese Regulation verantwortlich sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden mit Transkriptomanalysen anderer Gruppen verglichen und die Aussagekraft von in silico-Recherchen bewertet. Candida albicans ist eine opportunistisch pathogene Hefe. Auch C. albicans ist in der Lage, Inositol, Cholin und Fetts{\"a}uren de novo zu synthetisieren. Ein Funktionshomolog zu INO1, das CaINO1, vermag eine entsprechende Nullmutation in S. cerevisiae zu komplementieren. Ebenso wurden in C. albicans die Gene CaCHO1, CaFAS1 und CaFAS2 f{\"u}r die Synthese von Cholin bzw. Fetts{\"a}uren identifiziert. Ferner besitzt C. albicans das dem Opi1-Protein strukturell und funktionell {\"a}hnelnde CaOpi1, welches ebenfalls in der Lage ist, eine IC-abh{\"a}ngige Genregulation in S. cerevisiae zu vermitteln. Die in silico Identifikation potentieller C. albicans Orthologer zu INO2 sowie zu INO4 gab Anlass zu der Annahme, dass die Regulation der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae und C. albicans konserviert vorliegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein unkonventionelles Intron im mutma{\"s}lichen CaINO4 Gen identifiziert und durch RT-PCR eine intronfreie cDNA des CaINO4 Gens erhalten. Mit den Produkten der mu tma{\"s}lichen Gene CaINO2 und CaINO4 wurden Protein/DNA- und Protein/Protein-Interaktionen untersucht und mit der Situation in S. cerevisiae verglichen. CaIno2 und CaIno4 sind in der Lage zu heterodimerisieren und an ICRE-Motive aus S. cerevisiae zu binden, jedoch konnte keine Bindung an den CaINO1 Promotor gezeigt werden. Weiterhin ist das Heterodimer der C. albicans-Proteine in der Lage, einer S. cerevisiae ino2 ino4 Doppelmutante ein Wachstum auf IC-freiem Medium zu erm{\"o}glichen. Keines der Gene kann jedoch allein die jeweils entsprechende ino2 oder ino4 Einfachmutation komplementieren. Weder CaIno2 noch CaIno4 interagieren mit CaOpi1, hingegen interagiert CaIno2 mit Opi1, ebenso CaOpi1 mit Ino2. Ferner interagiert CaIno2 wie auch CaIno4 mit CaSua7, nicht jedoch mit Sua7. Es konnte keine Interaktion zwischen Ino2 bzw. Ino4 mit CaIno4 bzw. CaIno2 festgestellt werden, ebensowenig eine Homodimerisierung der Proteine. {\"A}hnlich wie Ino2 enth{\"a}lt auch CaIno2 zwei Transkriptionsaktivi erungsdom{\"a}nen an entsprechenden Positionen und vergleichbarer Aktivierungsleistung. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit nicht, homozygote Mutationen der Gene CaINO2 und CaINO4 durch Gendisruption in die diploide Hefe C. albicans einzuf{\"u}hren, es konnten lediglich heteroallele Mutanten hergestellt werden. Dieser Befund ist ein Hinweis auf eine Rolle von CaIno2 und CaIno4 bei der Aktivierung essentieller Gene in C. albicans. Daher wurde mit Genaktivierungstests nach der CaIno2/CaIno4-Konsensusbindesequenz gesucht und diese dann verwendet, um potentielle Zielgene in silico zu identifizieren. Als Konsensussequenz wurde das Motiv BWTCASRTG erhalten. Dieses Motiv wurde weder vor CaINO1, CaFAS1 oder CaCHO1 gefunden, jedoch zeigte sich eine deutliche H{\"a}ufung des UAS-Elements vor mitochondrialen Genen, vor Genen der Ergosterolbiosynthese und besonders vor einer Vielzahl von Genen ribosomaler Proteine. Es kann aus diesen Daten gefolgert werden, dass CaIno2 und CaIno4 f{\"u}r die Aktivierung anderer, vermutlich essentieller Zielgene erforderlich sind als ihre Orthologen aus S. cerevisiae, w{\"a}hrend CaINO1 durch bisher unbekannte Faktoren reguliert wird.},
  language  = {de}
}