@phdthesis{Moehl2011, author = {Britta Sydne M{\"o}hl}, title = {Bedeutung des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus f{\"u}r den Virus-Eintritt und die Morphogenese}, journal = {Functional Role of the large tegument protein pUL36 of Pseudorabies Virus in virus entry and virion maturation}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001098-4}, year = {2011}, abstract = {Das 3084 Aminos{\"a}uren umfassende innere Tegumentprotein pUL36 des zu den Herpesviren z{\"a}hlenden Pseudorabies Virus (PrV) stellt ein multifunktionelles Protein dar, das f{\"u}r die sekund{\"a}re Umh{\"u}llung der Nukleokapside im Zytoplasma essentiell ist. Dar{\"u}ber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei der fr{\"u}hen Phase der Replikation, d.h. dem Transport der Nukleokapside zum Zellkern und der Andockung an die Kernpore als Voraussetzung f{\"u}r die Freisetzung der viralen DNA in den Zellkern. Um die Rolle von PrV pUL36 w{\"a}hrend des viralen Replikationszyklus weiter aufzukl{\"a}ren, wurden funktionelle Regionen identifiziert und bekannte Motive und Regionen mittels gezielter Deletion bzw. Mutagenese untersucht. Zun{\"a}chst wurden eine konservierte Deubiquitinylierungs (DUB)-Dom{\"a}ne und potentielle Leucin-Zipper-Motive im N-Terminus des Proteins, sowie eine Alanin- und Prolin-reiche Region im C-Terminus mittels gezielter Deletionen untersucht. Zus{\"a}tzlich wurden durch ungerichtete Transposon-vermittelte Mutagenese Insertionsmutanten hergestellt. Die Funktionalit{\"a}t dieser Mutanten wurde durch Komplementierung einer UL36-negativen PrV Mutante untersucht. Mutierte Proteine, in denen essentielle Regionen betroffen waren, konnten den Replikationsdefekt der Virusmutante nicht kompensieren, w{\"a}hrend f{\"u}r Mutanten, die den Defekt komplementieren konnten, stabile Virusrekombinanten isoliert wurden. Die ph{\"a}notypische Charakterisierung der Mutanten erfolgte mittels Plaquegr{\"o}{\"s}envergleich, Ein-Schritt-Wachstumskinetik und Ultrastrukturanalyse. Zus{\"a}tzlich wurden einige Mutanten hinsichtlich des Replikationsverhaltens in vivo in einem Mausmodell untersucht. Um die Funktion von PrV pUL36 aufzukl{\"a}ren, ist es notwendig die intrazellul{\"a}re Lokalisierung von pUL36 zu kennen. Dazu wurden Immunfluoreszenz- und Ultrastrukturanalysen mit vier gegen unterschiedliche Bereiche des pUL36 gerichteten Antiseren durchgef{\"u}hrt. Auch die potentiellen Kernlokalisierungssignale (NLS) wurden hinsichtlich ihrer Funktion untersucht und die N-terminalen NLS-Motive 1/2 deletiert. Trotz der Funktionalit{\"a}t der essentiellen N-terminalen NLS-Motive 1/2 (Abb. 11) wurde pUL36 w{\"a}hrend der Virusreplikation niemals im Zellkern nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Tegumentierung ausschlie{\"s}lich im Zytoplasma abl{\"a}uft. Die NLS vermitteln also bei der Infektion keinen Kerntransport des pUL36. Die Bedeutung der NLS k{\"o}nnte aber mit dem Transport der Kapside entlang der Mikrotubuli zum Zellkern und dem Andocken an die Kernporen zusammenh{\"a}ngen. Im Gegensatz dazu spielen die Leucin-Zipper (Abb. 11) offenbar bei der sekund{\"a}ren Umh{\"u}llung eine Rolle. Sie sind m{\"o}glicherweise an der Verbindung des inneren und {\"a}u{\"s}eren Teguments beteiligt. Im N-Terminus von pUL36 konnte zwischen der Interaktionsdom{\"a}ne mit dem Komplexpartner pUL37 und den Leucin-Zippern eine weitere wichtige Region (Abb. 11) identifiziert werden. Diese Region ist auch in die sekund{\"a}re Umh{\"u}llung im Zytoplasma involviert und k{\"o}nnte f{\"u}r den Transport der teilweise tegumentierten Nukleokapside zum Trans-Golgi-Netzwerk verantwortlich sein, wobei pUL36, nicht aber die pUL36-pUL37-Interaktion hierbei eine Rolle spielt. Die gleichzeitige Deletion der DUB-Dom{\"a}ne und der Alanin- und Prolin-reichen Region (Abb. 11) f{\"u}hrte zu einem Defekt bei der sekund{\"a}ren Umh{\"u}llung, wohingegen die Alanin- und Prolin-reiche Region allein f{\"u}r die Replikation von PrV kaum eine Rolle spielt. Allerdings konnte die Deletion nicht ohne Funktionsverlust weiter vergr{\"o}{\"s}ert werden, so dass die angrenzenden Bereiche f{\"u}r die Funktion von pUL36 essentiell sein k{\"o}nnten. Die zentrale Region von Aminos{\"a}ure 1540 bis 1987 (Abb. 11) grenzt an diese Alanin- und Prolin-reiche Region an und ist f{\"u}r die Funktion von pUL36 essentiell, was durch den Funktionsverlust nach Insertionsmutagenese (mit einer Ausnahme) in diesem Bereich demonstriert wurde. Demnach k{\"o}nnte diese Region eine Rolle w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Phase der Infektion, wie z.B. beim Transport der Kapside zum Zellkern und/oder beim Andocken der Kapside an die Kernpore und der Freilassung der DNA in den Zellkern spielen. Der essentielle C-Terminus von pUL36 (Abb. 11) kann wahrscheinlich auf die Aminos{\"a}uren 3022 bis 3066 eingegrenzt werden, so dass nicht nur die letzten 6, sondern wom{\"o}glich die endst{\"a}ndigen 18 Aminos{\"a}uren f{\"u}r die Funktion von pUL36 nicht gebraucht werden.}, language = {de} }