TY  - THES
U1  - Dissertation / Habilitation
A1  - Behrens, Geoffrey A.
T1  - Protein-Engineering von Enzymen des Hydantoinase-Prozesses
N2  - Carbamoylasen und Hydantoinasen werden im „Hydantoinase-Prozess“ großindustriell zur Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren eingesetzt. Durch Verwendung einer Hydantoin-Racemase kann eine Ausbeute von theoretisch 100 % erreicht werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie die beteiligten Enzyme mittels Protein-Design, an neue Substrate angepasst werden können. Dabei wurde die Carbamoylase aus A. aurescens einem gene-shuffling mit den eng verwandten beta-Ureidopropionasen aus S. kluyveri und A. tumefaciens unterzogen. Weiterhin wurde ein durch Dockingexperimente gestütztes rationales Design durchgeführt und auf dieser Basis gezielte Mutationen im aktiven Zentrum der Carbamoylase eingebracht, sowie fokussierte Bibliotheken des aktiven Zentrums erzeugt. Es konnte die Akzeptanz von β-Aminosäurederivaten als Substrat in dieser Carbamoylase erreicht werden. Das aktive Zentrum einer Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. wurde ebenfalls mittels rationalem Design vergrößert um eine Akzeptanz von 5,5-disubstituierten Hydantoinen zu ermöglichen. Die Aktivitätsmessung gegenüber den neuen Substraten wurde in einem mehrstufigen Assaysystem durchgeführt. Dieses System basierte auf einem auf Ammoniummangel beruhenden Wachstumsassay, einem NADH Assay mit Glutamat-Dehydrogenase als Kopplungsenzym, sowie auf direktem HPLC Nachweis.
N2  - Carbamoylases and hydantoinases are industrially used in the “hydantoinase-process“ for synthesis of enantiopure amino acids. Using a hydantoin-racemase enables a theoretical yield of 100%. This thesis aimed at the protein-engineering of the partaking enzymes in order to allow for new substrates. The carbamoylase from A. aurescens was used in a gene-shuffling experiment with the closely related beta-ureidopropionases from S. kluyveri and A. tumefaciens. Furthermore rational design based on docking experiments was performed. Based on this targeted mutations as well as focused libraries were created in the carbamoylases active site. The acceptance of β-amino acid derivatives could be achieved. The active site of a hydantoinase from Ochrobactrum spec. was enlarged using rational design in order to achieve reactivity towards 5,5-disubstituted hydantoins. Activity was monitored used a multi-step assay system. This system was based on a growth assay relying on ammonia-starvation, an NADH-assay with glutamate-dehydrogenase as coupling enzyme and direct HPLC detection.
KW  - Proteindesign
KW  - Dihydropyrimidinase
KW  - Molekulardesign
KW  - Hydantoinase-Prozess
KW  - Carbamoylase
KW  - Selektionsassay
KW  - hydantoinase-process
KW  - carbamoylase
KW  - selection-assay
KW  - protein-engineering
KW  - hydantoinase
Y2  - 2014
U6  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002169-2
UN  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002169-2
ER  -