@phdthesis{Bonn2015,
  author    = {Florian Bonn},
  title     = {Analyse der Antibiotikastress-Antwort von Staphylococcus aureus},
  journal    = {Analysis of the Antibioticstress response of Staphylococcus aureus},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002287-7},
  year      = {2015},
  abstract  = {Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden f{\"u}r Proteom-Untersuchungen. F{\"u}r die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die H{\"a}lfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgef{\"u}hrt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminos{\"a}uren, die im Peptidoglykan-Vorl{\"a}ufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erh{\"o}hter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erh{\"o}hte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus St{\"a}mmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivit{\"a}t beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazellul{\"a}re Proteine mit einer Trichloressigs{\"a}ure (TCE)-F{\"a}llung gef{\"a}llt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-F{\"a}llung hat verschiedene Nachteile. Nach der F{\"a}llung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verd{\"u}nnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erh{\"a}ltliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das urspr{\"u}nglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ans{\"a}tzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion f{\"u}r die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Pr{\"a}inkubation der StrataClean-Partikel in Salzs{\"a}ure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verd{\"u}nnten L{\"o}sungen (20 µg Protein in 200 ml Fl{\"u}ssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll m{\"o}glich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean F{\"a}llung Proteine unabh{\"a}ngig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch f{\"u}r absolute Quantifizierungsans{\"a}tze interessant. Als weitere Anwendung k{\"o}nnen StrataClean-gebundene Proteine f{\"u}r mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das erm{\"o}glicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige K{\"u}hlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein tempor{\"a}rer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium w{\"a}hrend des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verst{\"a}rkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erh{\"o}hte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich gr{\"o}{\"s}er wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erh{\"o}ht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zellul{\"a}re Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausf{\"u}llt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranst{\"a}ndigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgel{\"o}ste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgel{\"o}st werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung k{\"o}nnen so erkl{\"a}rt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion f{\"u}r die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollst{\"a}ndig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.},
  language  = {de}
}