@phdthesis{Gutjahr2011, author = {Melanie Gutjahr}, title = {Charakterisierung des extrazellul{\"a}ren Proteoms von Staphylococcus aureus und Analyse der Wirt-Pathogen Interaktionen bei der Infektion humaner Epithelzellen mit Staphylococcus aureus}, journal = {Characterization of the extracellular proteome of Staphylococcus aureus and analysis of the host-pathogen interaction after infection of human epithelial cells with Staphylococcus aureus}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000915-0}, year = {2011}, abstract = {Staphylococcus aureus ist ein ubiquit{\"a}r verbreitetes Bakterium. H{\"a}ufig als Kommensale des Menschen vorkommend, z{\"a}hlt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenit{\"a}ts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, h{\"a}molytische Toxine, Gewebe-zerst{\"o}rende Enzyme und Oberfl{\"a}chenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellul{\"a}ren Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellul{\"a}ren Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) erm{\"o}glichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-H{\"a}molysin, gamma-H{\"a}molysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellul{\"a}ren Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellul{\"a}ren Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellul{\"a}ren Proteoms nicht grunds{\"a}tzlich {\"a}ndert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verst{\"a}rkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-H{\"a}molysin, gamma-H{\"a}molysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur f{\"u}r die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adh{\"a}sine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich w{\"a}hrend der exponentiellen Wachstumsphase f{\"u}r die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte f{\"u}r clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) erg{\"a}nzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellul{\"a}ren Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen best{\"a}tigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellul{\"a}rer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellul{\"a}ren Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazellul{\"a}re Enzyme die Erschlie{\"s}ung von N{\"a}hrstoffquellen in extremen Habitaten beg{\"u}nstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion n{\"a}her zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchf{\"u}hrung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm erm{\"o}glichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch f{\"u}r die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgef{\"u}hrt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zun{\"a}chst zu einer Integrin-vermittelten Adh{\"a}sion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus f{\"u}hrte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen f{\"u}hrt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen erm{\"o}glichen.}, language = {de} }