@phdthesis{Hellberg2018,
  author    = {Teresa Hellberg},
  title     = {Molekulare Analyse des Kernfreisetzungskomplexes des Pseudorabies Virus},
  journal    = {Molecular Analysis of the nuclear egress complex of pseudorabies virus},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002992-0},
  year      = {2018},
  abstract  = {Herpesviren nutzen einen Vesikel-vermittelten Transportweg f{\"u}r die Translokation von Nukleokapsiden aus dem Zellkern, um f{\"u}r die weitere Virusmorphogenese in das Zytoplasma zu gelangen. Den daf{\"u}r notwendigen Kernfreisetzungskomplex (nuclear egress complex; NEC) bilden zwei konservierte herpesvirale Proteine, die als pUL34 und pUL31 bezeichnet werden. Die Kristallstrukturen der NECs aus verschiedenen Herpesviren zeigten eine stabile Interaktion zwischen der N-terminalen Dom{\"a}ne von pUL31 und dem Kern von pUL34. Dar{\"u}ber hinaus geh{\"o}ren die am st{\"a}rksten konservierten Reste von pUL31 zu einem Zinkfinger-Motiv (ZNF). Zur Kl{\"a}rung der funktionellen Bedeutung des ZNF-Motivs in PrV pUL31, das aus drei Cysteinen (C73, C89 und C92) der CR1 und einem Histidin (H188) der CR3 besteht, wurden die Cysteine einzeln zu Serinresten und das Histidin H188 zu Alanin substituiert. Funktionelle Analysen der mutierten Proteine, die in vitro mit artifiziellen Membranen und in situ in eukaryotischen Zellen durchgef{\"u}hrt wurden, zeigten, dass das ZNF-Motiv eine wesentliche Voraussetzung f{\"u}r die NEC-Bildung und die notwendige Membranver{\"a}nderung darstellt. Der N-terminale Bereich von pUL31 und der anderen Homologen ist sehr variabel und wurde daher in den Konstrukten f{\"u}r die Kristallisierung weggelassen. Wie auch einige andere pUL31-Homologe enth{\"a}lt PrV pUL31 ein Kernlokalisationssignal (NLS) im N-Terminus f{\"u}r einen effizienten Kernimport. Neben der Funktionalit{\"a}t des Kernimports scheint dieser spezifische Bereich ebenfalls eine Rolle bei der Freisetzung von Nukleokapsiden aus dem Kernspalt, der Vorbeugung von einer vorzeitigen Komplexbildung im Zytoplasma, der Translokation der reifen Kapside an die INM und bei der Regulierung des envelopment/deenvelopment Prozesses {\"u}ber Phosphorylierung zu spielen. Um zu untersuchen welche zus{\"a}tzlichen Funktionen der N-terminale Bereich einnimmt, wurde der N-Terminus von PrV pUL31 schrittweise verk{\"u}rzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aminos{\"a}uren 2-13 (pUL31-N14), einschlie{\"s}lich des Hauptteils des vorhergesagten NLS, f{\"u}r die NEC-Bildung und -Funktion entbehrlich sind. Die Deletion von vier zus{\"a}tzlichen Aminos{\"a}uren (pUL31-N18), die alle grundlegenden Patches eliminierte, f{\"u}hrte jedoch zu einem defekten Protein. Die vollst{\"a}ndige Deletion der 25 N-terminalen Aminos{\"a}uren zeigte in Gegenwart von Wildtyp pUL31 eine Inhibierung des Kernaustritts. pUL31-N18, was {\"u}berwiegend im Zytoplasma gefunden wurde, zeigte keinen dominant-negativen Effekt. Die Phosphorylierung der beiden vorhergesagten Stellen im N-Terminus von PrV pUL31 (S12/S13) spielt offensichtlich keine Rolle beim Kernaustritt. Die Titer von PrV-Mutanten denen pUL34 oder pUL31 fehlt, werden drastisch reduziert, jedoch die Freisetzung infekti{\"o}ser Nachkommen nicht komplett inhibiert, was auf einen alternativen Austrittsweg hinweist. Wiederholtes Passagieren dieser Mutanten f{\"u}hrte zu Revertanten, die eine Wildtyp-{\"a}hnliche Replikation wiedererlangten. PrV-ΔUL34Pass und PrV-ΔUL31Pass umgingen dabei den vesikul{\"a}ren Transportweg durch das Induzieren einer Fragmentierung der Zellkernmembran (NEBD). Um zu testen, ob CDKs eine Rolle im viral induzierten NEBD spielen, wurden Wildtyp- (wt) oder dominant-negative (DN) Versionen der zellul{\"a}ren CDKs 1-6 getestet. In Gegenwart von CDK2DN wurden die Titer f{\"u}r beide Viren signifikant reduziert. Ultrastrukturelle Analysen zeigten, dass die Freisetzung von PrV-Ka prim{\"a}ren Virionen aus dem perinukle{\"a}ren Raum beeintr{\"a}chtigt oder verz{\"o}gert war und NEBD nur selten in PrV-ΔUL34Pass-ΔgG-CDK2DN-infizierten Zellen beobachtet wurde. Die genaue Zusammensetzung der prim{\"a}ren Virionen sowie der Maschinerie f{\"u}r die Verschmelzung der prim{\"a}ren H{\"u}lle mit der {\"a}u{\"s}eren Kernmembran sind nicht bekannt. Um virale und/oder zellul{\"a}re Proteine und andere prim{\"a}re Virion-Komponenten zu identifizieren, sollen prim{\"a}r umh{\"u}llte Virionen aus dem perinukle{\"a}ren Raum isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert werden. Da die Reinigung der prim{\"a}ren Virionen aus dem perinukle{\"a}ren Raum nicht ganz einfach ist, wurde das membranverankerte pUL34 mit verschiedenen Affinit{\"a}tsmarken markiert. Vier markierte pUL34-Konstrukte wurden nach Transfektion und Infektion generiert und getestet. Drei von ihnen erwiesen sich als funktionell w{\"a}hrend des herpesviralen Kernaustritts und es konnten stabil exprimierende Zelllinien hergestellt werden. Diese Zelllinien bilden nun eine solide Grundlage f{\"u}r weitere Experimente, um zuverl{\"a}ssige Protokolle f{\"u}r die Reinigung von prim{\"a}ren Virionen aus dem perinukle{\"a}ren Raum zu etablieren.},
  language  = {de}
}