@phdthesis{Gall2015,
  author    = {Mechthild Gall},
  title     = {Biotransformation von Flavonoiden},
  journal    = {Biotransformation of flavonoids},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002348-8},
  year      = {2015},
  abstract  = {Neben verschiedenen gesundheitsf{\"o}rdernden Eigenschaften hat das Flavonoid Phloretin eine s{\"u}{\"s}kraftverst{\"a}rkende Wirkung. Es ist nicht nur in der Pharma- und Kosmetikindustrie, sondern auch als Aromastoff f{\"u}r die Lebensmittelproduktion von Interesse. Bislang gab es kein vielversprechendes, biotechnologisches System zur Herstellung von Phloretin. Die Extraktion aus Pflanzen f{\"u}hrt aufgrund niedriger und schwankender Konzentrationen zu einer schlechten Verf{\"u}gbarkeit. Chemisch synthetisiertes Phloretin hingegen kann aufgrund der „Europ{\"a}ischen Aromenverordnung“ nicht als „nat{\"u}rlicher Aromastoff“ deklariert werden. Daher ist Phloretin als „nat{\"u}rlicher Aromastoff“ relativ teuer und f{\"u}r die Aromenindustrie kaum nutzbar. Ziel dieser Arbeit war es, einen effizienten Weg zur biotechnologischen Produktion von Phloretin zu finden. Als Substrat sollte bevorzugt Naringenin eingesetzt werden. Obwohl {\"a}hnliche Reaktionswege in der Literatur beschrieben wurden, konnte mit ausgew{\"a}hlten filament{\"o}sen Pilzen in Ganzzellbiokatalysen keine Phloretinbildung beobachtet werden. Es gibt jedoch auch Bakterien, die in der Lage sind, die Zielreaktion auszuf{\"u}hren. Da es sich hierbei ausschlie{\"s}lich um obligate Anaerobier handelt, eignen sich diese St{\"a}mme kaum f{\"u}r die biotechnologische Produktion von Phloretin. Au{\"s}erdem erfolgt in diesen Bakterien die Zielreaktion als Teil des Naringeninabbaus, das entstehende Phloretin wird abgebaut. {\"U}ber die Zielreaktion im anaeroben Bakterium Eubacterium ramulus lagen bereits Informationen aus anderen Forschungsarbeiten vor, darunter auch ein Sequenzfragment vom N-Terminus der Chalconisomerase (CHI). Die CHI katalysiert die Isomerisierung von Naringenin zu Naringeninchalcon. Aus der Literatur ging hervor, dass E. ramulus die Zielreaktion von Naringenin {\"u}ber Naringeninchalcon zum Phloretin durchf{\"u}hren kann, aber dass au{\"s}er der CHI ein weiteres Enzym beteiligt ist. Das genetische Potential von E. ramulus sollte genutzt werden, um einen rekombinanten Mikroorganismus zu generieren. Nach der Sequenzierung des Genoms von E. ramulus konnte die N-terminale Sequenz in der vorliegenden Arbeit genutzt werden, um in silico das Gen der CHI zu identifizieren. Da vermutet wurde, dass f{\"u}r die Reduktion von Naringeninchalcon zu Phloretin eine Enoatreduktase (ERED) verantwortlich ist, wurde {\"u}ber eine BLAST-Analyse ein konserviertes Motiv f{\"u}r Enoatreduktasen ermittelt, mit dem im Genom von E. ramulus das Gen einer ERED in silico identifiziert wurde. Die Gene wurden anschlie{\"s}end in E. coli kloniert. F{\"u}r die CHI konnte eine sehr gute {\"U}berexpression und enzymatische Aktivit{\"a}t in zellfreien Biokatalysen nachgewiesen werden. Der Aktivit{\"a}tsnachweis erm{\"o}glichte auch die Aufreinigung der CHI aus dem Proteinrohextrakt. In der Diplomarbeit von M. Thomsen wurde die Aufreinigung optimiert. Der Aufreinigungsprozess beinhaltete eine Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Gelfiltration und f{\"u}hrte zu einer sehr hohen Reinheit der CHI. Das aufgereinigte Enzym wurde anschlie{\"s}end biochemisch charakterisiert. Au{\"s}erdem wurden mit dem rekombinanten Stamm (mit Genen f{\"u}r CHI und ERED) Versuche im Ganzzellsystem mit Naringenin durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde festgestellt, dass die Reaktion zum Zielprodukt Phloretin empfindlich gegen{\"u}ber Sauerstoff ist. Unter anaerober Atmosph{\"a}re konnte in diesem System eine h{\"o}here Phloretinbildung beobachtet werden. Da die CHI in vorherigen Untersuchungen keine Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Sauerstoff gezeigt hatte, wurden in der Diplomarbeit von C. Peters Expression und Aktivit{\"a}t der ERED unter diesem Aspekt n{\"a}her untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Expression der ERED unter anaeroben Bedingungen erfolgen sollte, das Enzym ist jedoch auch unter Anwesenheit von Sauerstoff aktiv. Die in der Literatur beschriebenen Ans{\"a}tze zur Entwicklung von biotechnologischen Verfahren zur Phloretinproduktion basieren vor allem auf dem Einsatz pflanzlicher Gene und f{\"u}hrten bisher nur zu geringen Produktkonzentrationen. In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, ein neues System zur biotechnologischen Produktion von Phloretin zu entwickeln, mit dem eine h{\"o}here Ausbeute erzielt werden kann. Basierend auf den neu identifizierten Genen aus E. ramulus, die erfolgreich in E. coli exprimiert wurden, wird das Problem der rekombinanten Expression eukaryotischer Gene in Prokaryoten umgangen. Im Vergleich zu E. ramulus ist E. coli in der Biotechnologie bereits etabliert und relativ unempfindlich gegen{\"u}ber Sauerstoff. Au{\"s}erdem findet der Phloretinabbau, wie er in E. ramulus und in verwandten Bakterien ablaufen w{\"u}rde, in E. coli nicht statt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es f{\"u}r die Weiterentwicklung der industriellen Biotechnologie vorteilhaft ist, das enorme Potential des bakteriellen Stoffwechsels durch Gentechnik nutzbar zu machen. Durch diese Strategie wird „nachhaltige Biokatalyse auf neuen Wegen“ in der Flavonoidbiotechnologie erm{\"o}glicht.},
  language  = {de}
}