@phdthesis{Schliessmann2010,
  author    = {Anna Schlie{\"s}mann},
  title     = {Protein engineering of a Pseudomonas fluorescens esterase - Alteration of substrate specificity and stereoselectivity},
  journal    = {Protein engineering einer Pseudomonas fluorescens Esterase - {\"A}nderung von Substratspezifit{\"a}t und Stereoselektivit{\"a}t},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000823-0},
  year      = {2010},
  abstract  = {Das Ziel dieser Arbeit war die Validierung der OSCARR Methode (One-pot, simple cassette randomization and recombination) f{\"u}r fokussierte gerichtete Evolution, die von Dr. Hidalgo entwickelt wurde. Sie basiert auf der Megaprimer PCR, die {\"a}u{\"s}eren Primer besitzen unterschiedliche Schmelztemperaturen und asymmetrische Zyklen vor der Zugabe des Vorw{\"a}rtsprimers dienen der Unterdr{\"u}ckung von Wildtyp-Amplifikation. Als mutagene primer dienen sogenannte spiked oligonukleotide, die mit Hilfe eines Algorithmus entworfen werden und strikt definierte Nukleotidzusammensetzungen an jeder Position aufweisen. Eine OSCARR Bibliothek der Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) mit ca. 8000 Klonen wurde angelegt und auf ver{\"a}nderte Kettenl{\"a}ngenspezifit{\"a}t {\"u}berpr{\"u}ft. Zwei Mutanten mit erh{\"o}hter Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber mittelkettigen p-Nitrophenylestern wurden identifiziert, die beide die Mutation F126I tragen. Durch diese Mutation wird der Substrattunnel erweitert, wodurch gr{\"o}{\"s}eren Substraten der Zugang zum aktiven Zentrum erleichtert wird. Eine Mutante trug die zus{\"a}tzliche Mutation G120S, die eine katalytische Tetrade vervollst{\"a}ndigt, wie sie in Serinproteasen vorliegt. F126 beeinflusst die Kettenl{\"a}ngenspezifit{\"a}t allerdings st{\"a}rker, so dass weitere Aminos{\"a}uren des Substrattunnels („bottleneck“) mutiert wurden, um die {\"O}ffnung weiter zu vergr{\"o}{\"s}ern. Es wurden Einfach-, Doppel-, Dreifach- und Vierfachmutanten generiert, die vor allem Kombinationen aus F126L, F144L, F159L und I225L sind. Diese Mutanten wurden dann auf ver{\"a}nderte Enantioselektivit{\"a}t gegen{\"u}ber chiralen S{\"a}uren und Alkoholen {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}r die Substrate 1-Phenyl-1-propylacetat (2), 1-Phenyl-2-propylacetat (3) und 1-Phenyl-1-ethylacetat (4) wurden Mutanten mit erh{\"o}hter Enantioselektivit{\"a}t gefunden. I225L spielt eine wichtige Rolle, da es unabdingbar f{\"u}r die Enantioselektivit{\"a}t gegen{\"u}ber 3 ist, w{\"a}hrend es die selektivit{\"a}t gegen{\"u}ber 2 zerst{\"o}rt, was durch Vergleich der Dreifachmutante ohne I225L mit der Vierfachmutante offensichtlich wird. Die Einfachmutante I225L ist allerdings weniger selektiv gegen{\"u}ber 3 als der Wildtyp, synergistische Effekte zwischen Mutationen sind also von gro{\"s}er Wichtigkeit. Der PFE I Wildtyp besitzt bereits eine gute Enantioselektivit{\"a}t gegen{\"u}ber 4, aber alle analysierten Mutanten {\"u}bertreffen den Wildtyp deutlich. Mit Hilfe des Programms YASARA wurden Dockings f{\"u}r beide Enantiomere von 2 und 3 in den PFE I Wildtyp und die jeweils beste Mutante durchgef{\"u}hrt. Durch die Erweiterung k{\"o}nnen die Substrate im Wildtyp ihren Phenylring immer in Richtung des Tunnels orientieren, dies ist im Wildtyp nur f{\"u}r (R)-2 m{\"o}glich. Die Reste 126 und 144 sind relativ weit vom Substrat entfernt und beeinflussen vermutlich die Diffusion. Weiterhin sollte promiskuitive Amidase-Aktivit{\"a}t in der PFE I hervorgerufen werden. Auf der Suche nach strukturell homologen Enzymen mit Amidase-Aktivit{\"a}t fand sich die --Lactamase aus Aureobacterium sp., die nach ihrer Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem Vince Lactam 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on benannt wurde. Biokatalysen mit der PFE I und einigen Mutanten zeigen exzellente Selektivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem (-)-lactam. Die spezifischen Aktivit{\"a}ten einiger aufgereinigter Enzyme wurden bestimmt, die Aktivit{\"a}t einiger Mutanten lag in der selben Gr{\"o}{\"s}enordnung wie die Aktivit{\"a}t der Lactamase.},
  language  = {en}
}