@phdthesis{Pham2012,
  author    = {Thi Minh Ha Pham},
  title     = {Amperometric detection of hormonal activity by a yeast cell biosensor},
  journal    = {Amperometrische Detektion von hormonaler Aktivitaet mittels eines Hefe basierten Biosensors},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001312-4},
  year      = {2012},
  abstract  = {Durch den st{\"a}ndig steigenden Einsatz von nat{\"u}rlichen und synthetischen {\"O}strogenen bzw. Chemikalien mit {\"o}strogener Wirkung, kommt es heutzutage vermehrt zu Umweltbelastungen insbesondere f{\"u}r aquatisch lebende Organismen. Um auf derartige steigende Umweltbelastungen Einfluss nehmen zu k{\"o}nnen, war die Entwicklung eines geeigneten Nachweisverfahrens notwendig, welches die Nachteile bereits existierender Analyseverfahren und Bioassays zum Nachweis {\"o}strogener Verbindungen, beispielsweise bei der Automatisierung bzw. der kontinuierlichen Messung, verbessert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines f{\"u}r die semi-online Messungen ausgelegten Messverfahrens zur Bestimmung von {\"o}strogen-wirksamen Substanzen. Dieses neue Messsystem, EstraMonitor, ist eine Kombination aus transgenen A. adeninivorans Hefezellen (G1212/YRC102-hERa-phyK) als mikrobieller Komponente und einer amperometrischen Messeinheit f{\"u}r {\"o}strogene Aktivit{\"a}t. Die Hefezellen (Kaiser et al., 2010) co-exprimieren den humanen {\"O}strogen-Rezeptor (hERa), sowie eine rekombinante Phytase (phyK, aus Klebsiella sp. ASR1) als Reporter, deren Gen unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors mit {\"O}strogen-Response-Elementen (ERE) steht. Damit sezernieren die transgenen Hefezellen in Gegenwart von {\"o}strogen-wirksamen Substanzen rekombinante Phytase in das Medium, wo sie als Substrat zugegebenes p-Aminophenylphosphat (p-APP) dephosphoryliert. Die Oxidation von p-Aminophenol (p-AP) wiederum setzt proportional zur Phytaseaktivit{\"a}t Elektronen frei, die sich amperometrisch messen lassen. Auf diese Weise kann {\"u}ber die Phytaseaktivit{\"a}t die Konzentration an {\"o}strogen-wirksamen Substanzen im Probenmaterial berechnet werden. F{\"u}r amperometrische Messungen mit nicht-immobilisierten A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK Zellen wurde 150 mV als optimales Potential ermittelt. Die damit gemessenen EC50 und LoD Werte lagen f{\"u}r 17-Estradiol (E2) bei 69,9 ng L-1 bzw. 44,5 ng L-1. Sie lie{\"s}en sich mit einem kommerziellen Poteniostat (Palmsens) best{\"a}tigen (78,1 ng L-1 bzw. 43,9 ng L-1). Das gesamte Prozedere des EstraMonitor Verfahrens kann innerhalb von nur ca. 4 h abgeschlossen werden. Um die Handhabbarkeit, Langzeitstabilit{\"a}t und Wiederverwendbarkeit der mikrobiellen Sensorkomponente zu verbessern, wurden immobilisierte Hefezellen eingesetzt. Damit entfielen Arbeitsschritte wie Sterilisation, Kultivierung und Zentrifugation, was f{\"u}r eine semi-online, automatische und kontinuierliche {\"U}berwachung von z.B. Kl{\"a}ranlagen essentiell ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ermittelt, dass immobilisierte A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK Zellen bei 4 °C bis zu 30 Tage stabil sind und bis zu 15 mal wieder verwendet werden k{\"o}nnen. Die amperometrisch detektierten EC50 und LoD Werte f{\"u}r E2 lagen bei 20,9 und 8,3 ng L-1. Erste Realprobenmessungen mit E2 belasteten, nicht-vorbehandelten Abwasserproben belegten, dass die A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK Zellen aufgrund ihrer relativ hohen Salztoleranz bis zu einer Konzentration von 5\% NaCl einsetzbar sind. Damit l{\"a}sst sich der EstraMonitor zum Nachweis {\"o}strogener Aktivit{\"a}t im Abwasser ohne Vorbehandlung, Extraktion, Konzentration und Sterilisation der Proben einsetzen. Um die Sensitivit{\"a}t der Nachweismethode, sowie vor allem deren Analysezeit weiter zu verk{\"u}rzen, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit A. adeninivorans G1214/YRC103-hERa-phyK eine neue mikrobielle Sensorkomponente konstruiert und damit erste Tests durchgef{\"u}hrt. Mit ihr lie{\"s} sich bereits nach 2-st{\"u}ndiger E2-Inkubation ein entsprechendes Messsignal detektieren. Damit konnte mit diesen verbesserten transgenen Hefezellen das Einsatzgebiet des EstraMonitors erweitert werden. Dar{\"u}ber hinaus war es ebenfalls m{\"o}glich, die Kosten der Messmethode zu senken, indem das kosteng{\"u}nstigere Substrat Ascorbins{\"a}ure 2-phosphat (AA2P) eingesetzt wurde. Die damit erreichten EC50 und LoD Werte f{\"u}r E2 mit 15,69 und 0,92 ng L-1 waren im Vergleich zum bisher genutzten Substrat p-APP (20,09 und 8,3 ng L-1) sensitiver. Insgesamt kann festgestellt werden, dass der EstraMonitor ein komplett automatisiertes System zur Probenanalyse einschlie{\"s}lich Mess- und Kalibrier-Prozessen, sowie einer Alarmfunktion ist. Er bietet erstmals die M{\"o}glichkeit zur sensitiven, kosteng{\"u}nstigen, schnellen, automatischen und kontinuierlichen semi-online Kontrolle der {\"o}strogenen Aktivit{\"a}t, beispielsweise an Kl{\"a}ranlagen.},
  language  = {en}
}