@phdthesis{Bartsch2010,
  author    = {Sebastian Bartsch},
  title     = {Proteindesign einer Phenylalanin-Ammonium-Lyase - Ver{\"a}nderung des Substratspektrums und Untersuchungen zum Mechanismus},
  journal    = {Proteindesign of a Phenylalanine-Ammonia-Lyase - Change of Substrate Specificity and Investigations about the Mechanism},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000824-5},
  year      = {2010},
  abstract  = {Zun{\"a}chst sollte Aktivit{\"a}t der Phenylalanin-Ammonium-Lyase aus Petroselinum crispum (pcPAL) zur nicht-oxidativen Desaminierung des korrespondierenden Alkohols von Phenylalanin, Phenylalaninol generiert werden. Dazu wurden hochdurchsatzf{\"a}hige Methoden zur Selektion, wie auch zur Durchmusterung von Mutantenbibliotheken etabliert. Es wurde fokussierte, gerichtete Evolution durchgef{\"u}hrt und zwei Mutantenbibliotheken mit Mutationen im Bereich der Bindungsstelle des Substrates erfolglos auf Aktivit{\"a}t durchsucht. Computersimulationen f{\"u}hrten zur Annahme, dass Phenylalaninol wahrscheinlich nicht ausreichend im aktiven Zentrum gebunden werden konnte. Aus diesem Grund wurde eine zus{\"a}tzliche Wasserstoffbr{\"u}cke durch Verwendung von Tyrosinol als Substrat und der pcPAL-Phe-137-His Mutante eingef{\"u}hrt, welche nach Computersimulationen in der Lage war das Substrat ausreichend zu stabilisieren. Tats{\"a}chlich konnte durch die Einf{\"u}hrung einer zweiten Wasserstoffbr{\"u}cke durch rationales Proteindesign erstmals Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber einem Aminoalkohol generiert werden. Durch Verwendung der Tyrosin-Ammonium-Lyase aus Rhodobacter sphaeroides (rsTAL), dessen Wildtyp bereits ein Histidin an der korrespondierenden Position 137 (His-89 der rsTAL) besitzt, konnte vergleichbare Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Tyrosinol erreicht werden. Durch die Analyse der Substratbindung im aktiven Zentrum wurde ein neues Konzept f{\"u}r den Reaktionsmechanismus der aromatischen Aminos{\"a}ure-Ammonium-Lyasen, basierend auf der Aminos{\"a}ureposition 484 (pcPAL) entwickelt. Sequenz- und Strukturvergleiche zeigten eine substratabh{\"a}ngige Konservierung der Position 484 (pcPAL). Enzyme mit einer Pr{\"a}ferenz f{\"u}r Phenylalanin besa{\"s}en stets ein Glutamat, Tyrosin umsetzende Enzyme stets ein Asparagin an der entsprechenden Position. In silico Mutagenesen und Computersimulationen zeigten, dass ein Glutamat an der Position 484 (pcPAL) die Aminogruppe des Substrates bindet, wodurch die prosthetische, elektrophile MIO-Gruppe nur den aromatischen Ring in einer Friedel-Crafts {\"a}hnlichen Reaktion angreifen kann. Befand sich ein Asparagin an Position 484 (pcPAL) konnte die MIO Gruppe die Aminogruppe des Substrates erreichen und die nicht-oxidative Desaminierung {\"u}ber den E1cB Mechanismus mit einem MIO-Amino-Addukt durchf{\"u}hren. Somit wurde postuliert, dass die Ammonium-Lyasen und -Mutasen aromatischer Aminos{\"a}uren in Abh{\"a}ngigkeit der Aminos{\"a}ure an Position 484 (pcPAL) entweder den Friedel-Crafts-Mechanismus (mit Glu-484) oder den E1cB Mechanismus (mit Asn-484) katalysieren k{\"o}nnen. Durch die Verwendung von m-Tyrosin als „Mechanismusindikator“ und Verwendung der Glu-484-Asn-Mutante der pcPAL konnten experimentelle Hinweise erbracht werden, die die Annahmen aus der Computersimulationen unterst{\"u}tzten. Als Grund f{\"u}r die unkonventionelle, bisher einzigartige „mechanistische Promiskuit{\"a}t“ wurde ein unterschiedliches Konzept der Substratstabilisierung in PAL und TAL vermutet. Tyrosin wird durch Wasserstoffbr{\"u}cken der p-Hydroxylgruppe und der Carboxylgruppe im aktiven Zentrum gebunden, w{\"a}hrend Phenylalanin keine M{\"o}glichkeit bietet, den Phenylring eindeutig zu orientieren. Daher ist ein Glutamat an der Position 484 zur Substratbindung notwendig. Neben der pcPAL wurde die rsTAL zur Desaminierung von Tyrosinol getestet und zeigte ebenfalls pcPAL-{\"a}hnliche Aktivit{\"a}ten. Versuche, durch fokussierte, gerichtete Evolution und rationales Proteindesign aller Aminos{\"a}uren der Carboxyl- und Aminobindetasche, eine aktivere Mutante zur Umsetzung von Tyrosinol zu identifizieren, scheiterten. Computersimulationen wiesen auf ein Wasserstoffbr{\"u}ckennetzwerk hin, dessen St{\"o}rung sich stets durch verminderte oder zerst{\"o}rte Aktivit{\"a}t {\"a}u{\"s}erte. Somit musste festgestellt werden, dass in der Carboxyl- und Aminobindetasche keine Mutationen erlaubt sind, die Tyrosinol besser im aktiven Zentrum binden k{\"o}nnten. Daher wurden alternative Substrate untersucht. Tyrosinamid konnte ebenfalls langsam durch die pcPAL-Phe-137-His Mutante und die rsTAL desaminiert werden. Die biotechnologisch bedeutenderen Aminierungsreaktionen wurde gegen{\"u}ber verschiedenen para-substituierten Zimts{\"a}ureanaloga untersucht und mit der korrespondierenden Desaminierungsreaktion verglichen. Die pcPAL setzte Phenylalanin in der nat{\"u}rlichen Desaminierungsreaktion 10-fach schneller um als Zimts{\"a}ure aminiert werden konnte. p Nitro-Zimts{\"a}ure stellte sich aufgrund der elektronischen Effekte des Substituenten als besonders geeignetes Substrat f{\"u}r die Aminierungsreaktion heraus, welches 9-fach schneller durch die pcPAL aminiert wurde als Zimts{\"a}ure. Durch fokussierte, gerichtete Evolution konnten drei Mutanten identifiziert werden, die aufgrund geringerer, sterischer Hinderungen bis zu 1,7-fach gesteigerte Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber p-Nitro-Zimts{\"a}ure zeigten. Verglichen mit der nat{\"u}rlichen Desaminierungsreaktion der pcPAL gegen{\"u}ber Phenlyalanin, konnte die Phe-137-Val Mutante p Nitro Zimts{\"a}ure sogar 1,5-fach schneller aminieren. Somit konnte die Aktivit{\"a}t der Aminierungsreaktion, ausgehend vom pcPAL-Wildtyp gegen{\"u}ber Zimts{\"a}ure, um das 15-fache erh{\"o}ht werden. Die pcPAL-Phe-137-Val Mutante wies geringere Substratinhibierung sowie h{\"o}here Aktivit{\"a}ten gegen{\"u}ber einigen Substraten auf. In pr{\"a}parativen Biokatalysen wurde die hohe Aktivit{\"a}t und Enantioselektivit{\"a}t (eep ≥ 97\%) der Mutante, besonders in der asymmetrischen Aminierung von p-Nitro-Zimts{\"a}ure zu p-Nitro-L-Phenylalanin, erfolgreich auf einen gr{\"o}{\"s}eren Ma{\"s}stab {\"u}bertragen.},
  language  = {de}
}