@phdthesis{Mueller2016,
  author    = {Janett M{\"u}ller},
  title     = {Untersuchungen zur Acyltransferaseaktivit{\"a}t der Lipase A aus Candida antarctica},
  journal    = {Investigations of the Acyltransferase Activity of Lipase A from Candida antarctica},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002449-6},
  year      = {2016},
  abstract  = {Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Synthese von Fetts{\"a}ureestern aus Pflanzen{\"o}len mit Methanol bzw. Ethanol in Gegenwart von Wasser durch die Lipase CAL-A zu optimieren, wobei insbesondere die Bildung von freien Fetts{\"a}uren minimiert werden sollte. Zun{\"a}chst wurde ein Hochdurchsatztest zur Bestimmung der Acyltransferaseaktivit{\"a}t der CAL-A etabliert, welcher auf der Abnahme des Alkoholgehalts in Umesterungsreaktionen basiert. Dabei zeigte sich eine gute {\"U}bereinstimmung zwischen den Ums{\"a}tzen, die mit GC und dem Oxidase-Assay ermittelt wurden, wobei die Ums{\"a}tze nicht zu gering sein sollten da sonst gr{\"o}{\"s}ere Schwankungen im Oxidase-Assay m{\"o}glich sind. Durch das rationale Design anhand der gel{\"o}sten Struktur der CAL-A konnten vier Mutagenesepositionen identifiziert werden: Thr118, Asp122, Thr221 und Glu370. Durch den Austausch der Aminos{\"a}urereste an diesen Positionen gegen hydrophobere Aminos{\"a}uren wurden 28 CAL-A Varianten generiert. Diese wurden f{\"u}r eine initiales, qualitatives Screening eingesetzt, indem drei CAL-A Varianten eine {\"a}hnliche bzw. erh{\"o}hte Esterbildung im Vergleich zum Wildtyp zu haben schienen. Die drei Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala wurden daraufhin f{\"u}r weitere Untersuchungen in P. pastoris im Bioreaktor hergestellt und in Biokatalysen verwendet. Eine erh{\"o}hte Esterbildung f{\"u}r die Varianten Thr118Ile und Thr221Ala lie{\"s} sich jedoch nicht best{\"a}tigen, allerdings zeigte sich, dass die CAL-A Variante Asp122Leu deutlich weniger freie S{\"a}ure bildete als der CAL-A WT. In der anschlie{\"s}enden Charakterisierung von CAL-A Asp122Leu zeigte sich, dass diese Variante wie CAL-A WT auch thermostabil ist und dass beide Enzyme das gleiche pH- und Temperaturoptimum haben. Des Weiteren wurden CAL-A WT und Asp122Leu adsorptiv auf Lewatit VP OC 1600 immobilisiert und in Biokatalysen eingesetzt, in denen CAL-A Asp122Leu erneut deutlich weniger freie S{\"a}ure bildete. Dar{\"u}ber hinaus wurde auch der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Acyltransferaseaktivit{\"a}t der CAL-A untersucht. Es wurden dazu Biokatalysen mit Ethanol oder Methanol durchgef{\"u}hrt, in denen der Wassergehalt (5\% oder 10\% bezogen auf die Einwaage an {\"O}l) und die Reaktionstemperatur (30°C, 40°C oder 50°C) variiert wurden. Die Biokatalysen mit Methanol zeigten dabei generell einen hohen Umsatz zwischen 85-95\%, w{\"a}hrend die Biokatalysen mit Ethanol nur zu geringeren Ums{\"a}tzen f{\"u}hrten (55-85\%). Allerdings zeigte sich in einem Langzeitstabilit{\"a}tstest mit einer Biokatalysedauer von 97 h auch, dass Methanol das verwendete CAL-A Immobilisat st{\"a}rker inaktiviert als Ethanol. Ebenso musste bei einem Wassergehalt von nur 5\% die Methanolzugabe schrittweise erfolgen, um eine Inaktivierung des CAL-A Immobilisats zu verhindern. Somit konnte eine Optimierung der CAL A katalysierten Umesterungsreaktionen sowohl durch das Protein-Engineering des Biokatalysators als auch durch die Anpassung der Prozessbedingngen erreicht werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die auch zur Beurteilung der industriellen Anwendbarkeit eines solchen Prozesses beitragen k{\"o}nnen.},
  language  = {de}
}