@phdthesis{Henning2015,
  author    = {Ann-Kristin Henning},
  title     = {Anwendungen der qualitativen und quantitativen shotgun MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie im Rahmen der Tiergesundheit: Proteomanalyse des Rinderplasmas und Untersuchungen zu Virus-Wirt-Interaktionen},
  journal    = {Application of qualitative and quantitative shotgun MALDI-TOF/TOF mass spectrometry in the context of animal health: Analysis of bovine plasma proteome and investigations in virus-host interactions},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002369-0},
  year      = {2015},
  abstract  = {Mit der Entwicklung von sanften Ionisierungsverfahren wie der MALDI ist es seit Ende der 1980er Jahre m{\"o}glich, Proteine und Peptide effizient in die Gasphase zu {\"u}berf{\"u}hren, zu ionisieren und einer massenspektrometrischen Untersuchung zuzuf{\"u}hren. Dennoch bleibt die massenspektrometrische Proteomanalyse aufgrund seiner hohen Komplexit{\"a}t und hohen Konzentrationsunterschiede von bis zu 10 Zehnerpotenzen eine Herausforderung. Wegen ihrer leichten Zug{\"a}nglichkeit werden K{\"o}rperfl{\"u}ssigkeiten wie Plasma und Serum in der Medizin routinem{\"a}{\"s}ig f{\"u}r diagnostische Zwecke eingesetzt. Die Entwicklung von Biomarkern aus Plasma und Serum wird allerdings durch die extrem unterschiedlichen physiologischen Konzentrationen verschiedener Plasmaproteine sehr erschwert. Die Zusammensetzung des menschlichen Plasmas ist in zahlreichen Studien intensiv analysiert worden, wohingegen f{\"u}r das Rind bis auf einige 2D-elektrophoretische Kartierungen nur wenige Studien vorliegen. Das im Vergleich zu Humanproben geringere Interesse an Proben z.B. bovinen Ursprungs zeigt sich auch am Mangel spezifischer Reagenzien zu deren Analyse und f{\"u}hrt zu einer vergleichsweise schlechten Dokumentation der Zusammensetzung boviner Plasmen. F{\"u}r eine detaillierte Analyse des bovinen Plasmaproteoms wurde daher ein dreistufiger Arbeitsablauf entwickelt. In einem ersten Schritt sollte die Proteinkonzentration im Ausgangsmaterial angeglichen werden. Dazu wurden zwei Methoden miteinander verglichen. Die bei humanen Proben angewandte Standardmethode der Extraktion von Albumin mit CB-modifizierten Matrizen ergab keine zufriedenstellende Bindungsspezifizit{\"a}t f{\"u}r BSA und ist daher f{\"u}r das Rind und andere getestete Nutztiere nicht anwendbar. Im Gegensatz dazu f{\"u}hrte die Egalisierung mittels CPLL zu der gew{\"u}nschten Angleichung der Proteinkonzentration und zu einer deutlichen Erh{\"o}hung der Ausbeuten an identifizierten Proteinen in der MS-Analyse. Der zweite Schritt des Arbeitsablaufes dient der Reduktion der Probenkomplexit{\"a}t durch Fraktionierung der Proben mit den folgenden drei Verfahren: (i) die SDS-PAGE mit anschlie{\"s}endem In-Gel-Verdau („geLC-MS“), (ii) die gelfreie pr{\"a}parative isoelektrische Fokussierung („offgeLC-MS“) der Plasmaproteine oder (iii) die Fraktionierung der proteolytischen Peptide durch pr{\"a}parative gelfreie Fokussierung. Die dabei erhaltenen Fraktionen wurden im dritten Schritt durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS analysiert. Alle drei Fraktionierungsstrategien f{\"u}hrten nochmals zu einer verbesserten Ausbeute an Proteinidentifizierungen, wobei sich die gelfreie Peptidfokussierung als leistungsf{\"a}higstes Verfahren erwies. Die drei Fraktionierungsmethoden sind teilweise komplement{\"a}r, da von den insgesamt 296 identifizierten Proteinen lediglich 96 in allen drei Ans{\"a}tzen mittels MS nachweisbar waren. Nach einer weiteren Shotgun-Analyse mit einer anderen Protease wurde aus allen verf{\"u}gbaren Daten schlie{\"s}lich ein Gesamtkatalog von 480 bovinen Plasmaproteinen erstellt. W{\"a}hrend der Plasmaproteomstudie wurde auf Basis einer Zufallsbeobachtung eine alternative Methode zur Abreicherung von abundanten Serumproteinen entwickelt. Die Verd{\"u}nnung oder Dialyse von Serumproben f{\"u}hrte bei leicht sauren pH-Werten reproduzierbar zur Bildung eines Niederschlags, in dem die Konzentrationen der einzelnen Proteine {\"a}hnlich ausgeglichen schienen wie nach einer Extraktion mit CPLL. Das Pr{\"a}zipitat wurde mittels qualitativer und quantitativer MS n{\"a}her charakterisiert. Im Vergleich mit einem parallel analysierten CPLL-behandeltem Serum wurde eine {\"a}hnlich effiziente Entfernung von BSA aufgezeigt. Die Proteinzusammensetzung beider Pr{\"a}parate erwies sich jedoch nach Analyse mittels 1D und 2D Gelelektrophorese und nLC-MALDI-TOF/TOF MS als signifikant unterschiedlich. Bez{\"u}glich der Abreicherung von abundanten und der Anreicherung von weniger abundanten Proteinen wiesen beide Verfahren unterschiedliche Profile auf, die nach Einf{\"u}hrung einer Isotopenmarkierung mittels quantitativer MS charakterisiert wurden. Beide Verfahren waren exzellent reproduzierbar. F{\"u}r eine eingehende Analyse des Pr{\"a}zipitats wurden nach erfolgtem tryptischen Verdau die Peptide durch pr{\"a}parative gelfreie Fokussierung fraktioniert und die Fraktionen sowohl durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS als auch mit einem Orbitrap Massenspektrometer analysiert. Auf diese Weise konnten im Pr{\"a}zipitat insgesamt 306 Proteine identifiziert werden. Die GO-Analyse zeigte, dass darin typische Plasmaproteine angereichert sind. Die Methode eignet sich damit hervorragend als Erg{\"a}nzung zum CPLL-Verfahren. Virusbedingte Erkrankungen von Wildtieren und Nutztieren werden zunehmend auch unter dem Aspekt der {\"U}bertragbarkeit auf den Menschen betrachtet. Zu solchen Erregern mit zoonotischem Potential geh{\"o}ren auch die zur Gattung Henipavirus z{\"a}hlenden Arten Hendravirus (HeV) und Nipahvirus (NiV). Das Matrixprotein dieser Viren ist f{\"u}r den vollst{\"a}ndigen Zusammenbau des Viruspartikels und den Budding-Prozess bei der Virusfreisetzung verantwortlich und unterliegt einer nukleo-zytoplasmatische Passage. Welche Interaktionen zwischen Virus und Wirt w{\"a}hrend dieses Prozesses genau ablaufen und welche zellul{\"a}ren Faktoren dabei eine Rolle spielen, ist bisher nicht bekannt. Um solche Faktoren zu identifizieren wurden daher Proteinkomplexe charakterisiert, die durch Affinit{\"a}tsreinigung mit Strep-markiertem HeV M isoliert wurden. Dabei wurde die Interaktion von ANP32B mit HeV M mit Hilfe der MALDI-TOF/TOF MS nachgewiesen und durch weitere Analysen best{\"a}tigt. So gelang in reziproken Co-Immunpr{\"a}zipitationen die F{\"a}llung des jeweils anderen Bindungspartners und in fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen wurde gezeigt, dass M nur bei Anwesenheit des ANP32B im Zellkern akkumuliert. Dies wurde f{\"u}r HeV M und NiV M sowohl in transfizierten als auch in virusinfizierten Zellen nachgewiesen. Die Unterdr{\"u}ckung der ANP32B Expression in infizierten Zellen hatte keinen Einfluss auf den Budding-Prozess, so dass die Hypothese, die nukleo-zytoplasmatische Passage des M-Proteins sei essentiell f{\"u}r die Virusfreisetzung, nicht best{\"a}tigt werden konnte.},
  language  = {de}
}