@phdthesis{Koehlitz2009,
  author    = {Isabel K{\"o}hlitz},
  title     = {Rekombinante Expression, Reinigung und Charakterisierung der neuralen Zellerkennungsmolek{\"u}le P0 und L1},
  journal    = {Recombinant expression, purification, and characterisation of the neural cell adhesion molecules P0 and L1},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000621-3},
  year      = {2009},
  abstract  = {Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die rekombinante Expression und Reinigung der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der neuralen Zellerkennungsmolek{\"u}le P0 und L1. Die gereinigten Proteine sollten f{\"u}r Strukturanalysen verwendet werden. Da es sich sowohl bei P0 als auch bei L1 um Glykoproteine handelt, wurde die rekombinante Expression in eukaryotischen Systemen durchgef{\"u}hrt. Die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des Zelladh{\"a}sionsmolek{\"u}ls L1 wurde als Fusionsprotein (L1-TEV-Fc) mit einem durch TEV-Protease spaltbaren Fc-Tag in CHO-Zellen exprimiert, die das L1-TEV-Fc in den Zellkultur{\"u}berstand sezernierten. Das L1- TEV-Fc konnte erfolgreich {\"u}ber eine Protein A-S{\"a}ule aufgereinigt werden. Seine biologische Aktivit{\"a}t wurde in einem Neuritenwachstums-Assay nachgewiesen. Um strukturelle Analysen an der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne durchf{\"u}hren zu k{\"o}nnen, sollte der Fc-Tag mit der TEV-Protease abgespalten werden. Obwohl verschiedene Reaktionsparameter wie Temperatur, Inkubationszeit, Konzentration der TEVProtease und die Konzentration der Detergenzien variiert wurden, war eine Spaltung des L1-TEV-Fc im Rahmen dieser Arbeit nicht m{\"o}glich. Das Zellerkennungsmolek{\"u}l P0 ist das h{\"a}ufigste Protein im Myelin des peripheren Nervensystems. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte neben der wildtypischen auch eine mutierte Form der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des P0-Proteins in Pichia pastoris exprimiert werden. Die mutierte Form des P0-Proteins enthielt einen Aminos{\"a}ureaustausch an Position 106 von Isoleucin zu Leucin (Ile106Leu), welcher beim Menschen zu einer schweren Form der Charcot-Marie-Tooth’schen Krankheit vom Typ 1B f{\"u}hrt. Sowohl die wildtypische als auch die Ile106Leu-Form der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des P0-Proteins konnten in Pichia pastoris exprimiert werden, und wurden als Fusionsproteine mit einem Myc- und einem sechsfachen Histidin-Tag in den {\"U}berstand sezerniert. Die Aufreinigung erfolgte {\"u}ber Ni-NTA-Agarose-Beads. Durch eine Fermentation im 35 l-Ma{\"s}stab konnten beide Fusionsproteine f{\"u}r strukturelle Analysen in gr{\"o}{\"s}erer Menge produziert und aufgereinigt werden. Eine anschlie{\"s}ende Analyse mittels Dynamischer Laserlichtstreuung (DLS) zeigte, dass die Voraussetzungen f{\"u}r die Durchf{\"u}hrung eines Kristallisationsscreens mit 480 Bedingungen gegeben waren. Durch Deglykosylierung mit N-Glykosidase F und 1D-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des wildtypischen P0-Proteins aus Pichia pastoris glykosyliert ist. Eine Hyperglykosylierung konnte ausgeschlossen werden. Neben dem Einfluss der Ile106Leu-Mutation auf die Struktur der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne wurde auch ihr Einfluss auf die homophile Interaktion des P0-Proteins untersucht. In einem Aggregations-Assay mit transient transfizierten CHO-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen, die das wildtypische P0 voller L{\"a}nge exprimierten, im Verh{\"a}ltnis zu P0-Ile106Leu-exprimierenden Zellen st{\"a}rker aggregierten. Die Ile106Leu-Mutation wirkt sich also offenbar negativ auf die homophile Interaktion des P0-Proteins aus.},
  language  = {de}
}