@phdthesis{Nishtala2012,
  author    = {Krishnatej Nishtala},
  title     = {Proteomic analysis of disease associated changes in animal models of dilated cardiomyopathy},
  journal    = {Proteomanalyse Krankenheitsbezogener Ver{\"a}nderungen bei Dilatative Kardiomyopathie im Tiermodellen},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001293-9},
  year      = {2012},
  abstract  = {Dilatative Kardiomyopathie ist eine Erkrankung, die durch einen progressiven Verlust der kontraktilen Funktion und einer Vergr{\"o}{\"s}erung des linken Ventrikels gekennzeichnet ist. Die damit einhergehenden Fehlfunktionen des Herzens stellen den Grund f{\"u}r eine Herztransplantation dar. Neben genetischen Ursachen spielen auch virale Infektionen sowie die Autoimmunantwort eine Rolle in der {\"A}tiologie der Erkrankung. Unter den Viren, die eine derartige Erkrankung hervorrufen, sind vorwiegend Coxsackie B3 Viren (CVB3) mit der Entwicklung und dem Fortschreiten der Erkrankung assoziiert. Die durch Coxsackie-Viren in M{\"a}usen induzierte Myokarditis bildet das Krankheitsbild der humanen Myokarditis und dilatativen Kardiomyopathie ab. In diesem Tiermodell entwickelt sich innerhalb von 90 Tagen nach Infektion zun{\"a}chst eine akute Myokarditis, die in ein chronisches Krankheitsbild {\"u}bergeht und sich zu einer dilatativen Kardiomyopathie sowie kongestiver Herzfehlfunktion manifestiert. Obwohl inzwischen zahlreiche Informationen zum Fortschreiten der Erkrankung bekannt sind, ist das Verst{\"a}ndnis zu den molekularen Hintergr{\"u}nden immer noch unzureichend. In der vorliegenden Arbeit wurden vergleichende Proteomanalysen von Herzen aus A.BY/SnJ-M{\"a}usen 84 Tage nach Infektion (84 d p.i.) mit CVB3 und Herzen aus gleichalten nichtinfizierten M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt. Zur Charakterisierung der {\"A}nderungen auf Proteinebene wurden 2D-DIGE und gelfreie LC-MS/MS als Methoden genutzt und die Ergebnisse mittels Western Blot und Immunohistochemie validiert. Insgesamt wurden 101 verschiedene Proteine identifiziert, die in den Herzen mit CVB3 infizierter A.BY/SnJ-M{\"a}use (84 d p.i.) im Vergleich zu gleichalten Kontrollen Ver{\"a}nderungen zeigten und mit dilatativer Kardiomyopathie assoziiert sind. Die umfassende Analyse durch DIGE und gelfreie Proteomics zeigte, dass in den Herzen erkrankter Tiere vor allem Proteine des Lipidstoffwechsels (18 \%), des Kohlenstoffwechsels (14 \%), der Zellmorphogenese (14 \%) und der respiratorischen Elektronentransportkette signifikante Ver{\"a}nderungen in der Menge aufwiesen. Der erhebliche Anstieg des Levels extrazellul{\"a}rer Matrixproteine in Herzen infizierter M{\"a}use (84 d p.i.) ist Hinweis auf eine extensive Fibrose. Auf der anderen Seite wurden zum Energiestoffwechsel geh{\"o}rende Proteine in geringerer Menge in den Herzen infizierter M{\"a}use im Vergleich zu Kontrolltieren nachgewiesen. Aus diesen Proteomdaten wie auch den gemessenen geringeren Aktivit{\"a}ten der Komplexe I-IV der Elektronentransportkette in A.BY/SnJ-M{\"a}usen (84 d p.i.) im Vergleich zu Kontrollen, kann auf eine verminderte Energieversorgung in dilatierten Herzen geschlossen werden. Au{\"s}erdem wurden auch Proteine, die an der Muskelkontraktion beteiligt sind, in Herzen infizierter Tiere in geringerer Menge gefunden, woraus auf eine Beeintr{\"a}chtigung der myokardialen Kontraktion bei virus-induzierter dilatativer Kardiomyopathie geschlussfolgert werden kann. Die {\"A}nderungen bei den extrazellul{\"a}ren und kontraktilen Proteinen wurden durch die DIGE Analyse erfasst. Dagegen konnten die {\"A}nderungen bei Proteinen des Lipidstoffwechsels, die vornehmlich in den Mitochondrien lokalisiert sind und einen pI > 7 aufweisen durch die gelfreie Proteomanalyse aufgezeigt werden, was auch den Vorteil der Verwendung beider Methoden zeigt. Die gelbasierte Analyse unterst{\"u}tzt die Identifikation von Proteinisoformen und –spezies, die R{\"u}ckschl{\"u}sse auf posttranslationale Modifikationen bzw. die Proteinprozessierung zulassen. So konnten im Rahmen der Arbeit mit der Infektion verbundene {\"A}nderungen in der Phosphorylierung einzelner Proteine nachgewiesen werden. Die phosphospezifische F{\"a}rbung der Gele zeigte eine Zunahme der Phosphorylierung in infizierten Herzen sowohl f{\"u}r die ventrikul{\"a}re Form der regulatorischen leichten Myosinkette, wie auch Aktin (Isoform des glatten Muskels) und den Hitzeschockproteinen 90B und Beta-1. Ein Abbau von Proteinen wurde in den dilatierten Herzen nicht beobachtet. Wie zuvor schon erw{\"a}hnt, verl{\"a}uft die Entwicklung der dilatativen Kardiomyopathie im murinen Tiermodell {\"u}ber einen Zeitraum von 90 Tagen, in denen die M{\"a}use sich entwickeln und auch altern. Da auch das Alter ein Faktor ist, der die Empf{\"a}nglichkeit der Tiere f{\"u}r Krankheiten beeinflusst, wurden auch die durch Alterungsprozesse hervorgerufenen Ver{\"a}nderungen im Herzen von 4 Monate alten Tieren im Vergleich zu 1 Monat alten Kontrolltieren untersucht. Die komplement{\"a}re Analyse des Proteomes durch 2D-DIGE und gelfreie LC-MS/MS ergab 96 verschiedene Proteine, die altersassoziierte {\"A}nderungen aufwiesen und dem Lipidmetabolimus (19 \%), dem Proteintransport (17 \%) und der Elektronentransportkette zuzuordnen sind. Die in den Lipidstoffwechsel und Transport involvierten mitochondrialen Proteine Carnitin-o-palmitoyltransferase 1 und 2 sowie die Carnitin-O-acetyltransferase zeigten signifikant h{\"o}here Level in 4 Monate alten Tieren. Offenbar liegt in {\"a}lteren Tieren ein h{\"o}herer Energiebedarf vor, der auch durch die beobachteten niedrigeren Spiegel an Proteinen der respiratorischen Atmungskette, speziell der Untereinheiten der ATP- Synthase (Komplex V) mit verursacht sein kann. Weiterhin wurde in 4 Monate alten Tieren eine Zunahme der Menge von Proteinen, die am intrazellul{\"a}ren Transport beteiligt sind, beobachtet. Der erh{\"o}hte Spiegel an vesikul{\"a}ren Transportproteinen stellt wahrscheinlich einen sekund{\"a}ren Effekt dar, der zu einer mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziierten Proteinabbau f{\"u}hrt. In den zwei zuvor beschriebenen Studien wurden wesentliche {\"A}nderungen in der mitochondrialen Funktion und damit verbunden eine verminderte Energie-/ATP-Produktion beobachtet, was die Rolle der Mitochondrien in Gesundheit und Krankheitsentwicklung unterstreicht. Der Austausch von ADP/ATP entlang der mitochondrialen Membran erfolgt durch das Transportprotein Adeninnukleotidtranslocase 1 (ANT1). Um die Bedeutung von ANT1 im Herzen besser zu verstehen, wurden mittels LC-MS/MS Proteomanalysen von Herzen 3 Monate alter ANT1-{\"u}berexpremierender Ratten im Vergleich zu Organen aus gleichalten Wildtyptieren durchgef{\"u}hrt. Insgesamt wurden 433 Proteine anhand von mindestens 2 Peptiden identifiziert, von denen 87 geringf{\"u}gige, aber signifikante {\"A}nderungen in der Intensit{\"a}t aufwiesen. Proteine des Integrin-vermittelten Kinase-Signalweges sowie an der myokardialen Kontraktion beteiligte Proteine waren abundanter in Herzen der ANT1-{\"u}berexprimierenden Ratten, w{\"a}hrend Proteine der mitochondrialen Atmungskette im Vergleich zu Wildtyptieren geringere Level zeigten. Mittels Oxyblotanalysen konnte nachgewiesen werden, dass kein Unterschied in der Proteinoxidation im Herzen zwischen transgenen und Wildtyptieren besteht. Um den Einfluss der ANT1-{\"U}berexpression im Verlauf einer Virus-induzierten dilatativen Kardiomyopathie zu verstehen, wurden vergleichende Proteomanalysen auch f{\"u}r mitochondriale Fraktionen 8 Monate alter Ratten des Wildtyps und ANT1 transgener Tiere nach CVB3 Infektion durchgef{\"u}hrt. Von 370 identifizierten Proteinen wiesen 83 unterschiedliche Mengen in Herzen von Wildtyptieren und transgenen Tieren auf. In infizierten transgenen Tieren wurden vor allem geringere Mengen f{\"u}r Proteine der mitochondrialen Elektronentransportkette, des Fettstoffwechsels sowie an der Kontraktilit{\"a}t und der Zellstruktur beteiligter Proteine gemessen, so dass von einer Beeintr{\"a}chtigung dieser Zellfunktionen in transgenen Tieren im Vergleich zu Wildtyptieren ausgegangen werden kann. Neben den viralen Infektionen spielt auch die Autoimmunantwort eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Myokarditis und dilatativer Kardiomyopathie. Daher wurden auch Proteomanalysen f{\"u}r ein experimentelles Tiermodell durchgef{\"u}hrt, bei dem in Ratten durch die aktive Immunisierung mit Peptiden des FcγIIa- Rezeptors -CEPPWIQVLKEDTVTL (Peptid 1) benannt als FcR- Tiere und CRCRMEETGISEPI (Peptid 2) –als FcR2-Tiere bezeichnet- eine autoimmun- vermittelte Myokarditis induziert wird. Von den 303 mittels LC-MS/MS anhand von mindestens 2 Peptiden identifizierten Proteinen wiesen 43 bzw. 49 h{\"o}here Intensit{\"a}ten (>1,2 fach) in Herzen von FcR-Tieren bzw. von FcR2-Tieren im Vergleich zu Herzen von mit Adjuvans KLH behandelten Kontrolltieren auf. Die Mehrheit der Ver{\"a}nderungen (>70\%) wurde in beiden Autoimmunmodellen gleicherma{\"s}en beobachtet. So f{\"u}hrte die Immunisierung in beiden experimentellen Modellen zu einer akuten-Phase-Antwort. Au{\"s}erdem weist die Anreicherung der Proteine Lumican und Procollagen I alpha auf eine verst{\"a}rkte Fibrose in den Herzen nach Immunisierung hin, unabh{\"a}ngig davon, welches Peptid eingesetzt wurde. Insgesamt konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Proteomicsmethoden die Ver{\"a}nderungen im kardialen Proteinprofil in zwei Tiermodellen f{\"u}r die dilatative Kardiomyopathie – der Virus-induzierten und der autoimmun-induzierten dilatativen Kardiomyopathie - in Maus- und Rattenmodellen f{\"u}r diese Erkrankung charakterisiert werden. 2D-DIGE und die gelfreie LC-MS/MS sind komplement{\"a}re Techniken, die einen umfassenden Einblick in die {\"A}nderungen im Proteinprofil der Herzen der verschiedenen Tiermodelle erm{\"o}glichen. Das Virus-induzierte Modell der Kardiomyopathie wird dominiert durch eine ver{\"a}nderte mitochondriale Funktion, die zu einer Einschr{\"a}nkung des Energiestoffwechsels sowie einer Beeintr{\"a}chtigung der myokardialen Kontraktilit{\"a}t f{\"u}hrt, w{\"a}hrend die autoimmun-induzierte Kardiomyopathie eher durch eine Akute-Phase-Antwort charakterisiert wird. {\"A}nderungen der Mitochondrienfunktion wurden auch mit dem Alterungsprozess assoziiert in A.BY/SnJ M{\"a}usen beobachtet und unterstreichen die Bedeutung der Mitochondrien f{\"u}r den Gesundheitszustand von Individuen.},
  language  = {en}
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