@phdthesis{Dombos2009,
  author    = {Valeska Dombos},
  title     = {Untersuchungen zum Aufbau eines Assays zur in vitro Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms},
  journal    = {Studies for the design of an assay for the in vitro selection of a cytidine deaminase ribozyme},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000667-7},
  year      = {2009},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktionalisierung von RNAs im Hinblick auf die Selektion eines Ribozyms, das die Desaminierung von Cytidin zu Uridin katalysieren kann, durchgef{\"u}hrt. Die Desaminierung von Cytidin verl{\"a}uft proteinkatalysiert. Cytidindesaminasen (CDAs) sind im Nukleotidmetabolismus aller Lebewesen zu finden. In h{\"o}heren Eukaryoten spielen CDAs beim RNA editing eine Rolle. In S{\"a}ugetieren sind sie bedeutsam f{\"u}r die Immunabwehr. Ein Cytidindesaminase-Ribozym w{\"a}re in der Lage die gezielte Ver{\"a}nderung einer RNA-Sequenz zu katalysieren. Diese Eigenschaft w{\"a}re ein weiteres Indiz f{\"u}r eine pr{\"a}biotische RNA-Welt und k{\"o}nnte auch in der Gentherapie n{\"u}tzlich sein. Bei der in vitro Selektion ist die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek ein zentraler Punkt. 5’-Transkriptionspriming ist daf{\"u}r besonders gut geeignet, da es kotranskriptionell, w{\"a}hrend der Transkription der RNA, stattfindet. W{\"a}hrend der Transkription kann die T7 RNA Polymerase ein 5’-modifiziertes Guanosinmonophosphat am 5’-Ende, also am Anfang einer RNA-Sequenz, einbauen. Cytidin, das zu prozessierende Substrat der Selektion, wurde mit einem Guanosinmonophosphat verbunden. Solche modifizierten Guanosinmonophosphat-Verbindungen werden Initiatormolek{\"u}le genannt, da sie nur zu Beginn einer RNA-Transkription am 5’-Ende einer RNA eingebaut werden k{\"o}nnen. Um eine Selektion zu erm{\"o}glichen, wurde das Cytidin mit einer Markierung versehen. Es wurden zwei verschiedene Initiatormolek{\"u}le synthetisiert. Der eine Initiator bestand aus einer Guanosinmonophosphateinheit und einer Cytidineinheit, die eine Biotinmarkierung trug. Die Biotinmarkierung erm{\"o}glicht eine Selektion an der festen Phase durch die starke Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin. Bei erfolgreicher Reaktion der RNA wird diese von der Festphase getrennt und kann durch Waschen der Festphase isoliert werden. Der andere Initiator trug statt der Biotinmarkierung eine Fluoreszeinmarkierung. Die Selektion mit diesem Initiator w{\"u}rde in L{\"o}sung stattfinden. Fluoreszein-markierte RNAs besitzen eine andere gelektrophoretische Mobilit{\"a}t als unmarkierte RNAs. Bei der Selektion spalten aktive RNAs die Fluoreszeinmarkierung ab. Durch Gelaufreinigung der Selektionsans{\"a}tze k{\"o}nnten sie so auf Grund ihrer ver{\"a}nderten gelelektrophoretischen Mobilit{\"a}t isoliert werden. Zur Synthese der Molek{\"u}le wurden zwei unterschiedliche Synthesestrategien entwickelt und angewandt. Die erste Synthesestrategie bediente sich der Phosphoramiditchemie an der festen Phase und lieferte den Biotin-markierten Initiator in nanomolaren Mengen. Die zweite Strategie f{\"u}hrt zur Synthese des Fluoreszein-markierten Initiators und beinhaltete eine 18-stufige Synthese in L{\"o}sung, die eine Ausbeute des Initiators im µ-molaren Bereich erm{\"o}glichte. Die Funktionalisierung von RNA mit dem Biotin-markierten Initiator wurde qualitativ nachgewiesen mit Hilfe einer auf Northern Blotting und Chemilumineszenzdetektion aufbauenden Methode. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf einer Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin zur spezifischen Bindungen an die Biotinmarkierung inkubiert. Durch Zugabe eines Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemiluminszenzsignal induziert, welches mit einem empfindlichen Photosystem detektiert und dokumentiert werden kann. Der erfolgreiche Einbau der Fluoreszein-markierten Initiatormolek{\"u}le wurde qualitativ mit Hilfe denaturierender Gelelektrophorese und Fluoreszenzanregung bei einer Wellenl{\"a}nge von 365 nm nachgewiesen. Zur quantitativen Bestimmung des Einbaus wurde eine auf fluoreszenzspektroskopischen Anwendungen basierende Methode etabliert und erfolgreich angewendet. Dazu wurde eine zu 100\% 5’-Fluoreszein-markierte RNA mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens synthetisiert. Zur Erstellung einer Eichgerade mit dieser Referenz-RNA wurden Proben mit bekannten Konzentrationen mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrophotometers vermessen. Die jeweiligen gemessenen Fluoreszenzintensit{\"a}ten der Fluoreszenzemissionsmaxima der Proben wurden in einem Diagramm {\"u}ber der dazugeh{\"o}rigen Konzentration aufgetragen. Die so erstellte Eichgerade erm{\"o}glichte es anhand der gemessenen Fluoreszenzintensit{\"a}t einer Probe markierter RNAs die Konzentration der Probe zu ermitteln. Zur Bestimmung und Optimierung der Einbaueffizienz des Fluoreszein-markierten Initiators wurden Transkriptionspriming-reaktionen unter Variation der Transkriptionsbedingungen durchgef{\"u}hrt. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde so eine Einbaurate von 18\% erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit dokumentieren, dass grunds{\"a}tzlich beide Inititatormolek{\"u}le zur Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek und den damit verbundenen Selektionsstrategien, Festphase oder Selektion in L{\"o}sung, angewendet werden k{\"o}nnen. Die Fluoreszein-basierende Selektionsstrategie h{\"a}tte den Vorteil einer direkteren Identifizierung und spezifischeren Quantifizierung der funktionalisierten RNA-Bibliothek.},
  language  = {de}
}