@phdthesis{Nietz2023,
  author    = {Daniela Nietz},
  title     = {Identifizierung und Charakterisierung einer Lipase (ALIP2) und zweier Carboxylesterasen (BEST1 und BEST2) aus der Hefe Blastobotrys raffinosifermentans LS3},
  journal    = {Identification and characterization of a lipase (ALIP2) and two carboxylesterases (BEST1 and BEST2) from the yeast Blastobotrys raffinosifermentans LS3},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-86699},
  pages     = {144},
  year      = {2023},
  abstract  = {In unserem Alltag sind Polymere weit verbreitet. In Form von funktionellen Polymeren werden sie u.a. als Wirk- oder Effektstoff eingesetzt. Sie bestehen aus einem Tr{\"a}ger, an welchen {\"u}ber einen Spacer eine funktionelle Gruppe gebunden ist. Die Spacergruppen beeinflussen die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Polymere bzw. erm{\"o}glichen diese erst. Dadurch stellen sie in der pharmazeutischen Industrie und der medizinischen Chemie Schl{\"u}sselbausteine dar. Auch Monoester von symmetrischen Dicarbons{\"a}uren oder symmetrischen Diolen werden f{\"u}r die Einf{\"u}hrung von Spacergruppen verwendet. Sie k{\"o}nnen durch die Hydrolyse von Diestern oder Dioldiestern chemisch synthetisiert werden. Da diese Reaktion nicht selektiv erfolgt, entstehen Nebenprodukte wie Dis{\"a}uren oder Diole, die die Ausbeuten schm{\"a}lern und eine aufw{\"a}ndige Aufarbeitung notwendig machen. Selektive enzymatische Verfahren stellen eine echte Alternative dar, denn eine Trennung des Produkts vom Nebenprodukt ist nicht notwendig. Bisher sind nur wenige Enzyme bekannt und verf{\"u}gbar, die zur Synthese von Monoestern verwendet werden k{\"o}nnen. Ziel dieser Arbeit ist die Entdeckung neuer Lipasen und Carboxylesterasen als Biokatalysatoren zur Synthese von Monoestern, die zudem in ausreichender Verf{\"u}gbarkeit generiert werden sollen. Als Gendonor und Expressionssystem diente hierf{\"u}r die Hefe Blastobotrys raffinosifermentans. Die nicht-konventionelle, nicht-pathogene und thermotolerante Hefe B. raffinosifermentans weist ein breites Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen Spektrum auf, was sie f{\"u}r industrielle Anwendungen interessant macht. Aufgrund einer bereits vielfach eingesetzten, effizienten Transformationsmethode wurde die Hefe bereits zur Produktion verschiedener Proteine wie humanem Serumalbumin, Interleukin-6, Phosphatasen mit Phytase-Aktivit{\"a}t, Tannasen und einer Lipase eingesetzt. Die exzellenten Wachstumsparameter garantieren hohe Enzymausbeuten. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 30 putative Lipase- und Carboxylesterase-Gene in ihrem Genom durch Annotationsanalysen identifiziert. Diese Gene wurden isoliert, amplifiziert und in der Hefe selbst {\"u}berexprimiert. Die Proteinextrakte der erzeugten St{\"a}mme wurden anschlie{\"s}end auf Esteraseaktivit{\"a}t getestet, wovon sieben Kandidaten das Substrat p-Nitrophenylbutyrat (pNP-Butyrat) hydrolysierten. Anschlie{\"s}end wurde mittels eines Assays untersucht, ob die Enzyme die Hydrolyse der Substrate Adipins{\"a}urediethylester (DEA), Dimethyl trans-1,4-cyclohexandicarboxylat (DMCH), Terephthals{\"a}urediethylester (DETS) und Decandiol-dimethacryls{\"a}ureester (DDMAE) katalysieren. Vier Kandidaten hydrolysierten DEA und DMCH und ein Extrakt eignete sich zur Hydrolyse von DETS. Es folgten eine Testung auf Selektivit{\"a}t mittels Gaschromatographie mit gekoppeltem Flammenionisationsdetektor und eine affinit{\"a}tschromatographische Reinigung der f{\"u}nf Proteine. Dabei stellten sich die drei Kandidaten Alip2-6hp, 6h-Best1p und 6h-Best2p, eine putative Lipase und zwei putative Carboxylesterasen, als potenziell geeignete Kandidaten heraus. Anschlie{\"s}end erfolgte die biochemische Charakterisierung der drei Proteine. Das Temperatur-Optimum der Enzyme lag zwischen 31 °C und 41 °C und das pH-Optimum zwischen 6,6 und 7,0. Die Metallionen Fe2+, Fe3+ und Cu2+ inhibierten alle drei Biokatalysatoren und auch die Zugabe verschiedener L{\"o}sungsmittel verringerte ihre Aktivit{\"a}t. Die Untersuchung des Substratspektrums mit p-Nitrophenylestern mit Kettenl{\"a}ngen von C2 bis C18 zeigte eine Pr{\"a}ferenz von Alip2-6hp f{\"u}r mittelkettige pNP-Ester mit einem Maximum bei pNP-Caproat und von 6h-Best1p und 6h-Best2p f{\"u}r kurzkettige pNP-Ester mit einem Maximum bei pNP-Acetat. 6h-Best1p und 6h-Best2p zeigen damit das f{\"u}r Carboxylhydrolasen typische Substratspektrum. Da Lipasen {\"u}blicherweise langkettige Substrate bevorzugen, wurde die Klassifizierung f{\"u}r Alip2-6hp mittels Tween 20- und Oliven{\"o}l-Agarplattentest weiter untersucht. Das positive Ergebnis dieser Untersuchung l{\"a}sst auf eine Lipase schlie{\"s}en. Zur Bestimmung der Selektivit{\"a}t der Enzyme wurde die Hydrolyse von DEA und DMCH zeitlich per GC-FID verfolgt. Nach Derivatisierung der Carboxylgruppen war die quantitative Auswertung zum Gehalt an Monoester, Diester und Dis{\"a}ure m{\"o}glich. Es lie{\"s} sich damit die Hydrolyse von DEA mit 6h-Best1p best{\"a}tigen. Bessere Ergebnisse wurden mit Alip2-6hp f{\"u}r das Substrat DMCH erzielt und mit Abstand die schnellste Hydrolyse wurde mit DEA als Substrat erreicht. In gereinigter Form hydrolysierte Alip2-6hp das Substrat DEA selektiv zu MEA, sodass bis zu 96 \% Monoester synthetisiert werden konnten. Im Vergleich dazu wird MEA deutlich langsamer hydrolysiert. Zus{\"a}tzlich wurden f{\"u}nf unterschiedliche Formulierungen des Enzyms Alip2-6hp mit dem Substrat DEA getestet: (1) Rohextrakt, (2) freies, gereinigtes Enzym, (3) immobilisiertes, gereinigtes Enzym (Beads) und als Ganzzellkatalysatoren (4) permeabilisierte (Triton-) Zellen und (5) permeabilisierte, immobilisierte (Triton-) Zellen. Die vielversprechendsten Ergebnisse wurden mit isoliertem gereinigtem Enzym erzielt. DEA wurde vollst{\"a}ndig und spezifisch zu MEA umgesetzt. Zur Gew{\"a}hrleistung einer ausreichenden Verf{\"u}gbarkeit der Enzyme erfolgte die Kultivierung der {\"U}berexpressionsst{\"a}mme im Fermenter im Fed-batch. Der Alip2-6hp produzierende Hefestamm erbrachte Aktivit{\"a}ten von 674 U L-1, w{\"a}hrend der 6h-Best2p {\"U}berexpressionsstamm 2239 U L-1 produzierte.},
  language  = {de}
}