@phdthesis{Wolf2007,
  author    = {J{\"o}rn Wolf},
  title     = {Aufbau eines Assays zur in vitro-Selektion einer Adenosindesaminase aus einer RNA-Bibliothek},
  journal    = {Design of an Assay for the in vitro-Selection of an Adenosine Deaminase from an RNA Library},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000432-3},
  year      = {2007},
  abstract  = {Diese Arbeit beschreibt den Aufbau eines Assays zur Selektion eines Ribozyms, welches die Desaminierung von Adenosin zu Inosin katalysiert. Diese Reaktion spielt im Organismus, wo sie proteinkatalysiert abl{\"a}uft, eine wichtige Rolle (Nukleotidmetabolismus, RNA-Editing). Zus{\"a}tzlich besitzt ein solches Ribozym das Potenzial zur gezielten Ver{\"a}nderung von RNA-Sequenzen. Das Projekt hat somit evolutionstheoretische (RNA-Welt-Hypothese) als auch gentherapeutische Relevanz. Zentraler Punkt des vorgestellten Assays ist die Markierung einer Mischung verschiedener RNA-Sequenzen (= Bibliothek) mit dem Substrat Adenosin. Dieses tr{\"a}gt an der exozyklischen Aminogruppe eine Biotinfunktion. Wird diese Bibliothek auf einer festen Phase {\"u}ber die Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung immobilisiert und den Selektionsbedingungen unterworfen, werden Spezies mit der gew{\"u}nschten Aktivit{\"a}t in L{\"o}sung entlassen. Diese k{\"o}nnen eluiert und {\"u}ber RT-PCR angereichert werden. Die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek geschieht am 5’-Ende jeder Sequenz durch Transkriptionspriming aus einer chemisch synthetisierten DNA-Bibliothek in Gegenwart der vier NTPs und eines Guanosin-5’-monophosphatderivats, dem „Initiator“. Letzteres ist {\"u}ber die 5’-Phosphatfunktion mit dem biotinylierten Substrat Adenosin verkn{\"u}pft. Das Initiatormolek{\"u}l wurde in zwei Strategien synthetisiert. Die erste Strategie fand an der festen Phase unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens statt und lieferte Initiator in nanomolarem Ma{\"s}stab. Die zweite Strategie bestand aus einer 17-stufigen Synthese in L{\"o}sung und ergab fast identisches Initiatormolek{\"u}l in µmolarem Ma{\"s}stab. Beide Initiatormolek{\"u}le wurden erfolgreich zur Funktionalisierung einer RNA eingesetzt. Zur qualitativen Dokumentation des Einbaus des Initiators wurde eine auf Chemilumineszenzdetektion basierende Methode entwickelt. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf eine Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin inkubiert, welches spezifisch den Biotinrest bindet. Durch Zugabe eines m{\"o}glichen Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemilumineszenzsignal erzeugt, was {\"u}ber einen R{\"o}ntgenfilm dokumentiert wurde. Dieser qualitative Nachweis wurde erweitert, um die Einbaueffizienz zu quantifizieren. Dazu wurde eine RNA, welche zu 100\% mit dem Initiatormolek{\"u}l markiert war, mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens hergestellt. Diese als Standard fungierende RNA wurde in definierter Menge zusammen mit definierten Mengen an statistisch funktionalisierten Primingprodukt geblottet. Die Quantifizierung der Chemilumineszenz der Proben erfolgte mit Hilfe eines Photosystems und durch Integration der Signalintensit{\"a}ten. Dadurch konnte der Anteil der in den durchgef{\"u}hrten Primingreaktionen mit Initiator markierten RNA zu maximal 3 \% bestimmt werden. Obwohl eine Erh{\"o}hung dieses Wertes z.B. durch Optimierung der Initiatorstruktur w{\"u}nschenswert ist, ist damit die Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek in einer f{\"u}r die Selektion ausreichenden Menge durchaus m{\"o}glich. Zur Evaluation des Assays wurde der Selektionsschritt simuliert, in welchem ein {\"u}ber das Initiatormolek{\"u}l festphasengebundenes Ribozym spezifisch zur Selbstspaltung aktiviert wird. Zu diesem Zweck wurden ein Hammerheadriboyzm, ein Hairpinribozym sowie ein DNAzym untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Spaltaktivit{\"a}t aller drei Systeme durch Funktionalisierung mit dem Initiator in L{\"o}sung fast vollst{\"a}ndig inhibiert wird, unmarkierte Spezies unter identischen Bedingungen jedoch uneingeschr{\"a}nkte Spaltaktivit{\"a}t zeigen. Die beobachtete Inhibierung beruht auf einem intramolekularen Effekt, der m{\"o}glicherweise zu einer Verschiebung des Konformerengleichgewichts der Testsysteme hin zu spaltinaktiven Konformeren f{\"u}hrt. Zus{\"a}tzlich wurde die Spaltaktivit{\"a}t des mit Initiator markierten und an einer Festphase immobilisierten Hairpinribozyms untersucht. Auch hier war eine stark verringerte Spaltaktivit{\"a}t zu beobachten, welche jedoch in unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Festphase und Ribozym begr{\"u}ndet liegen k{\"o}nnten. Die verwendeten Systeme eignen sich offenbar nicht zur Evaluierung des Assays, was jedoch die M{\"o}glichkeit offen l{\"a}sst, dass im geplanten Assay selektierte RNA-Sequenzen die Funktionalisierung mit Initiator tolerieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben den Schluss, dass die gew{\"a}hlte Strategie zur Selektion der Adenosindesaminase einige Punkte beinhaltet, welche nach M{\"o}glichkeit optimiert werden m{\"u}ssen, um eine effizientere Selektion durchf{\"u}hren zu k{\"o}nnen. Prinzipiell ist die Vorraussetzung f{\"u}r die Selektion der Adenosindesaminase durch die beschriebene Methode jedoch geschaffen und kann basierend auf den vorgestellten Ergebnissen in zuk{\"u}nftigen Studien durchgef{\"u}hrt werden.},
  language  = {de}
}