@phdthesis{Kreibich2015,
  author    = {Anne Kreibich},
  title     = {Untersuchungen zum Reassortment von avi{\"a}ren und humanen Influenza-A-Viren des Subtyps H3 unter Verwendung der Reversen Genetik},
  journal    = {Investigations of the reassortment of avian and human influenza A viruses with subtype H3 using reverse genetics},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002386-7},
  year      = {2015},
  abstract  = {Die Segmentierung des Influenza-A-Virusgenoms und die damit verbundene M{\"o}glichkeit des Reassortments sind von gro{\"s}er Bedeutung f{\"u}r die Adaptation an einen neuen Wirt und die Entstehung von Pandemien. So wurden verschiedene Influenza-Pandemien des letzten Jahrhunderts durch ein humanes Virus ausgel{\"o}st, das mindestens das H{\"a}magglutinin (HA) eines avi{\"a}ren Influenza-A-Virus {\"u}bernommen hatte. Mit Hilfe der Reversen Genetik ist es m{\"o}glich, den Austausch von Segmenten zwischen verschiedenen Influenza-Viren detailliert zu untersuchen. Es k{\"o}nnen Erkenntnisse zur Art und H{\"a}ufigkeit von Reassortments gewonnen werden, die zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Entstehung potentiell pandemischer Viren f{\"u}hren. In der vorliegenden Arbeit wurde zun{\"a}chst die revers-genetische Methode der target-primed plasmid amplification erfolgreich zur Generierung des vollst{\"a}ndigen Plasmidsatzes des c-DNA-Genoms des humanen Influenza-A-Virus A/Denver/57 (H1N1) angewendet. Die Funktionsf{\"a}higkeit des klonierten Plasmidsatzes konnte durch Kotransfektionsexperimente gezeigt werden. In einem n{\"a}chsten Schritt wurde eine PCR etabliert, welche die simultane Amplifikation der cDNA der NS-, M-, NA- und NP-Segmente eines beliebigen Influenza-A-Virus erm{\"o}glicht und damit die zeitaufwendige Klonierung der Influenza-Gene deutlich beschleunigt. Daf{\"u}r wurde ein Primerpaar entwickelt, das an die konservierten Termini der Gensegmente bindet, aber am 3-Ende um die Gen-spezifischen Nukleotide verk{\"u}rzt ist. Mit den entwickelten Primern kann au{\"s}erdem das komplette Neuraminidase-Gen unabh{\"a}ngig vom Subtyp amplifiziert werden. In einer Reassortmentstudie konnte die etablierte PCR zur effektiven Genotypisierung eingesetzt werden. Gegenstand der Reassortmentstudie war die Frage, ob sich {\"a}ltere und j{\"u}ngere avi{\"a}re St{\"a}mme in ihrer F{\"a}higkeit, ihr HA an einen humanen Stamm abzugeben, unterscheiden. Au{\"s}erdem sollte untersucht werden, welche Segmente mit dem avi{\"a}ren HA kosegregieren. Daf{\"u}r wurden Doppelinfektionsversuche mit jeweils einem der beiden avi{\"a}ren Influenza-Viren A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (DkUkr63) bzw. A/Mallard/Germany/Wv64-67/05 (H3N2) (MallGer05) und dem humanen Influenza-Virus A/Hongkong/1/68 (H3N2) (Hk68) durchgef{\"u}hrt. Das Einf{\"u}hren einer Elastase-abh{\"a}ngigen HA-Schnittstelle in das humane Virus Hk68 erm{\"o}glichte eine effektive Selektion von Reassortanten mit avi{\"a}rem HA. Unter den jeweils 21 untersuchten Plaqueisolaten gab es 16 (DkUkr63) bzw. 18 (MallGer05) Reassortanten, die mindestens das avi{\"a}re HA erworben hatten. Geringe H{\"a}ufigkeiten des Auftretens bestimmter Reassortanten lieferte Hinweise bez{\"u}glich Beschr{\"a}nkungen im Reassortment. Bei der Genotypisierung der Plaqueisolate wurden f{\"u}r DkUkr63 sieben und f{\"u}r MallGer05 vierzehn verschiedene Reassortantenspezies gefunden. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch der Segmente von DkUkr63 gegen{\"u}ber denen von MallGer05 st{\"a}rker eingeschr{\"a}nkt ist. Bemerkenswert war die h{\"a}ufige Kosegregation des NA mit HA beider Vogelviren. Die Wachstumskinetik auf humanen A549-Zellen zeigte dar{\"u}ber hinaus auch eine gute Replikation f{\"u}r alle HA/NA-Reassortanten. Beide Viren geben also ihr HA wie auch ihr NA leicht an einen humanen Stamm ab. Andererseits war die geringe H{\"a}ufigkeiten von PB2- im Vergleich zu PB1-Reassortanten auff{\"a}llig. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch des PB2-Segments im Vergleich zu PB1 st{\"a}rker eingeschr{\"a}nkt ist. Eine der am besten replizierenden Reassortanten wies mit PB1, HA und NA von DkUkr63 die gleiche Genkonstellation auf wie das Pandemievirus der Asiatischen Grippe von 1957. Die Auswertung der Plaque-Morphologie ergab, dass die Plaque-Gr{\"o}{\"s}e der Reassortanten von der Herkunft des NA abh{\"a}ngig ist. Verglichen mit dem eingeschr{\"a}nkten Wachstum des avi{\"a}ren Elternvirus DkUkr63 zeigten die meisten seiner Reassortanten ein besseres Wachstum auf humanen A549-Zellen. Das j{\"u}ngere avi{\"a}re Elternvirus MallGer05 erreicht fast den Endtiter des humanen Hk68 und auch die meisten Reassortanten zeigten mit Hk68 vergleichbare Endtiter. Es wurden aber f{\"u}r beide Vogelviren auch einige Reassortanten gefunden, deren Replikation deutlich vermindert war, was auf eine geringe Kompatibilit{\"a}t der jeweiligen Segmente hindeutet. Sowohl f{\"u}r den {\"a}lteren als auch f{\"u}r den j{\"u}ngeren avi{\"a}ren Elternstamm wurden unter den gew{\"a}hlten Selektionsbedingungen verschiedene HA-Reassortanten mit guter Replikationsf{\"a}higkeit gefunden. Dementsprechend k{\"o}nnten auch unter nat{\"u}rlichen Bedingungen sogar niedrig pathogene avi{\"a}re Influenza-A-Viren mit geringer Adaptation an einen humanen Wirt bei Koinfektionen mit humanen Viren zur Bildung von neuen, potentiell pandemischen Viren beitragen.},
  language  = {de}
}