@phdthesis{Schuster2013,
  author    = {Franziska Schuster},
  title     = {Molekulare Mechanismen der prim{\"a}ren Umh{\"u}llung von Herpesviren},
  journal    = {Molecular mechanisms of herpesvirus primary envelopment},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001408-1},
  year      = {2013},
  abstract  = {Herpesviren nutzen zwei unterschiedliche Zellkompartimente f{\"u}r die Morphogenese. W{\"a}hrend der Kapsid-Zusammenbau und die DNA Verpackung im Zellkern stattfinden, erfolgt die weitere Assemblierung im Zytoplasma. Um dorthin zu gelangen muss die Kernmembranbarriere {\"u}berwunden werden. Hierf{\"u}r knospen die Nukleokapside an der inneren Kernmembran und erhalten dort eine prim{\"a}re Virush{\"u}lle, die allerdings nach Fusion mit der {\"a}u{\"s}eren Kernmembran wieder verloren geht. F{\"u}r diesen als envelopment-deenvelopment bezeichneten Vorgang ist ein Komplex aus zwei viralen Proteinen notwendig. Er besteht aus pUL34, einem Membranprotein der Kernmembran und dessen Interaktionspartner pUL31. Beide Proteine allein reichen aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran abzuschn{\"u}ren. Ziel dieser Arbeit war, diesen nuclear egress weiter zu charakterisieren. Hierf{\"u}r sollte zun{\"a}chst gekl{\"a}rt werden, welche Dom{\"a}nen von pUL34 f{\"u}r dessen korrekte Lokalisierung in der Kernmembran und der Interaktion mit dem Komplexpartner pUL31 notwendig sind. Dazu wurden chim{\"a}re Proteine aus Teilen des pUL34 und zellul{\"a}ren Proteinen der inneren Kernmembran hergestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die pUL34-Transmembrandom{\"a}ne keine virusspezifische Funktion besitzt und durch entsprechende Bereiche zellul{\"a}rer Proteine ausgetauscht werden kann. Auch die Erweiterung der Substitution auf 50 C-terminale Aminos{\"a}uren f{\"u}hrte zu einem funktionellen Protein, w{\"a}hrend ein Konstrukt mit einem Austausch von 100 C-terminalen Aminos{\"a}uren durch entsprechende Lap2{\"s} Sequenzen den Defekt der PrV-deltaUL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementieren konnte. Dennoch war noch immer eine Interaktion mit dem Komplexpartner m{\"o}glich. Dies zeigte, dass zwischen den C-terminalen Aminos{\"a}uren 50 und 100 ein virusspezifischer, funktionell wichtiger Bereich liegt, der in nachfolgenden Arbeiten weiter eingegrenzt werden muss. In fr{\"u}heren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aminos{\"a}uren 1-162 des PrV pUL34 f{\"u}r die Interaktion mit pUL31 ausreichen. F{\"u}r das engverwandte HSV-1 konnte dieser Bereich jedoch auf die Aminos{\"a}uren 137 und 181 eingegrenzt werden. Um dies f{\"u}r PrV pUL34 n{\"a}her zu untersuchen wurde das Konstrukt pUL34-LapNT hergestellt, bei dem die 100 N-terminalen Aminos{\"a}uren durch Lap2{\"s} Sequenzen ersetzt wurden. Hier zeigte sich jedoch, dass pUL34-LapNT das pUL31 nicht mehr an die innere Kernmembran rekrutieren konnte und folglich den Defekt der PrV-delta UL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementierte. Im Gegensatz zu HSV-1 scheinen hier auch die N-terminalen 100 Aminos{\"a}uren f{\"u}r die Interaktion mit pUL31 notwendig zu sein. Da die Expression von pUL34 und pUL31 allein ausreicht, um die Bildung von Membranvesikeln von der inneren Kernmembran abzuschn{\"u}ren, sollte im Weiteren getestet werden, ob auch Kapside in diese Vesikel aufgenommen werden. Da bei Herpesviren die Kapside autokatalytisch gebildet werden und dies bereits f{\"u}r einige Herpesviren {\"u}ber Expression in rekombinanten Baculoviren nachgestellt werden konnte, sollte versucht werden, dies auch f{\"u}r PrV zu etablieren. Dabei sollte die Kapsidbildung {\"u}ber Transduktion in S{\"a}ugerzellen unabh{\"a}ngig von einer PrV Infektion nachgestellt werden. Hierbei sollte gekl{\"a}rt werden, welche weiteren viralen Proteine, neben den eigentlichen Kapsidproteinen, wie z.B. das pUL17 und pUL25, f{\"u}r den nuclear egress notwendig sind. Obwohl alle Kapsidkomponenten kloniert und auch in Zellen exprimiert werden konnten, konnte keine Kapsidbildung nachgewiesen werden. Die Ursachen hierf{\"u}r konnten nicht gekl{\"a}rt werden. Auff{\"a}llig war, dass das Triplexprotein pUL38 in den Baculovirus-transduzierten Zelllysaten ein etwas anderes Laufverhalten als das in Zelllysaten PrV-infizierter Zellen aufwies, dessen Ursache nicht auf der Verwendung eines downstream lokalisierten Startkodons beruhte. Mit Hilfe dieser rekombinanten Baculovirusvektoren konnte jedoch gezeigt werden, dass das Hauptkapsidprotein pUL19 mit dem Ger{\"u}stprotein (pUL26 bzw. pUL26.5) und die Triplexproteine pUL18 und pUL38 gemeinsam in den Kern transportiert werden. Die Beteiligung zellul{\"a}rer Proteine am nuclear egress sollte {\"u}ber siRNA Experimente untersucht werden. In einer vorangegangen Arbeit war gezeigt worden, dass p97, eine zellul{\"a}re AAA+ATPase, nach Infektion vermehrt exprimiert wurde. Ziel war es, die p97 Expression {\"u}ber siRNA zu reduzieren und den Effekt auf die Virusinfektion zu untersuchen. Eine erfolgreiche siRNA Studie war bereits f{\"u}r p97 in Rattenzellen publiziert und sollte hier angewandt werden. Leider waren die zur Verf{\"u}gung stehenden Rattenzelllinien nur sehr ineffizient transfizierbar und zus{\"a}tzlich auch schlecht mit PrV infizierbar. Das eigene Design und die Anwendung von p97 spezifischer siRNA f{\"u}r Kaninchenzellen zeigte zwar die gew{\"u}nschte Reduktion der p97 Expression, war jedoch nur sehr schlecht reproduzierbar und konnte daher nicht f{\"u}r aussagekr{\"a}ftige Infektionsversuche verwendet werden.},
  language  = {de}
}