@phdthesis{Maass2014,
  author    = {Sandra Maa{\"s}},
  title     = {Relative und absolute Proteinquantifizierung in Bakterien},
  journal    = {Relative and absolute protein quantification in bacteria},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001911-6},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden f{\"u}r die Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden. Zum tieferen Verst{\"a}ndnis der Bakterienphysiologie ist es unabdingbar, Mengen{\"a}nderungen von Proteinen hochaufgel{\"o}st darstellen zu k{\"o}nnen. Relative Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von {\"A}nderungen der Menge eines Proteins zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al. 2011, Artikel I) angewendet, um Oberfl{\"a}chen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsst{\"a}mme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Mengen{\"a}nderung eines Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, erm{\"o}glicht aber nur bedingt Aussagen {\"u}ber die absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen sind jedoch Grundvoraussetzung f{\"u}r ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht nur im Kontext der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung f{\"u}r einen gro{\"s}en Teil der cytosolischen Proteine eines Organismus erm{\"o}glicht wird. In dieser Methode werden ausgew{\"a}hlte Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, f{\"u}r die Kalibration von hoch aufl{\"o}senden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es f{\"u}r die Analyse der Anpassung von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten f{\"u}r 467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. F{\"u}r die Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten n{\"o}tig: I) Selektion geeigneter Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI) Optimierung der vollst{\"a}ndigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte au{\"s}erdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele f{\"u}r die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen {\"u}bertragen l{\"a}sst, was den Aufwand f{\"u}r gro{\"s}e Zeitreihenexperimente deutlich reduziert. Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter Proteinquantifizierung kann durch eine erh{\"o}hte Reproduzierbarkeit, Aufl{\"o}sung und Sensitivit{\"a}t der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen f{\"u}hrte zu 25 \% mehr detektierbaren und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erh{\"o}hter Reproduzierbarkeit (Moche et al. 2013, Artikel III). Die zus{\"a}tzlich h{\"o}here Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer Qualit{\"a}t verringert au{\"s}erdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem f{\"u}r komplexe experimentelle Ans{\"a}tze. Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis w{\"a}hrend der physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, n{\"a}mlich Glukosehunger und Hitzestress, zu bestimmen (Maa{\"s} et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden Stressbedingungen erm{\"o}glicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten unterst{\"u}tzt wurde. Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine beschr{\"a}nkt ist, ist es f{\"u}r eine h{\"o}here Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit gelfreien Methoden zu erg{\"a}nzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten absoluten Quantifizierung von Proteinen im gro{\"s}en Ma{\"s}stab entwickelt und etabliert. In dieser gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabh{\"a}ngige, parallele Fragmentierung aller zeitgleich eluierenden Vorl{\"a}ufermolek{\"u}le (LC-MSE) genutzt. Auch f{\"u}r diese Methode der absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V).},
  language  = {de}
}