@phdthesis{Vauleon2007,
  author    = {St{\´e}phanie Vaul{\´e}on},
  title     = {Twinribozyme als molekulare Werkzeuge zur RNA Reparatur und Funktionalisierung},
  journal    = {Twinribozymes as molecular tools for RNA repair and functionalisation},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000368-9},
  year      = {2007},
  abstract  = {Verschiedene Strategien sind heute in der Entwicklung, um mit Hilfe von RNA Molek{\"u}len die genetische Information auf Transkriptebene zu korrigieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Twinribozyme durch den Austausch kleiner RNA Fragmente das Potential zur RNA Reparatur und ortsspezifischen RNA Funktionalisierung besitzen. Das Hairpinribozym katalysiert je nach Stabilit{\"a}t des Ribozym-Substrat-Komplexes die Spaltung bzw. die Ligation seines Substrats. Twinribozyme wurden durch Verkn{\"u}pfung von zwei Hairpinribozymeinheiten entwickelt. Die Spaltung eines RNA Substrates an den zwei katalytischen Stellen produziert drei Fragmente: beide {\"a}u{\"s}eren binden fest an das Twinribozym, w{\"a}hrend die Bindung des mittleren Fragments durch einen Vier-Nukleotid-Loop im Ribozymstrang destabilisiert wird. Dies f{\"o}rdert dessen Dissoziation gegen{\"u}ber dessen R{\"u}ckligation. Die Zugabe eines so genannten Reparaturoligonukleotids, das stabil an das Twinribozym anstelle des mittleren Fragments bindet, beg{\"u}nstigt dessen Assoziation zum Ribozym und dessen Ligation zu den {\"u}brigen Substratfragmenten. Das Ergebnis ist ein um vier Nukleotide verl{\"a}ngertes Reparaturprodukt. Dies stellt ein Modell f{\"u}r die Reparatur einer Vier-Nukleotid-Deletion auf mRNA Ebene dar. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die bestehende Reaktion kinetisch und thermodynamisch zu charakterisieren. Weiter wurde das Potential von Twinribozymen f{\"u}r die Reparatur anderer RNA Defekte und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung untersucht. Schlie{\"s}lich wurde die Twinribozym vermittelte Reparaturreaktion in Zellkulturen getestet. Beim urspr{\"u}nglichen Vier-Nukleotid-Deletionsmodell wurden unter {\"a}quimolaren Konzentrationen aller Fragmente und bei 10 mM Magnesiumchlorid und 37 °C 35 \% Reparaturprodukt erhalten. Kinetische Untersuchungen jeder Einzelreaktion konnten zeigen, dass die Tamdemkonfiguration des Twinribozyms die Spalt- und Ligationseigenschaften nicht beeintr{\"a}chtigt. In thermodynamischen und kinetischen Bindungsuntersuchungen von Modellduplexen, die der Austauschregion {\"a}hneln, wurde gezeigt, dass die Struktur des Ribozym-Substrat-Komplexes den Austausch der mittleren Fragmente stark f{\"o}rdert. Eine Voraussetzung zur biophysikalischen und biochemischen Untersuchungen von RNA Molek{\"u}len ist ihre ortsspezifische Markierung. Dies wird f{\"u}r bis zu 80 Nukleotide lange RNA Str{\"a}nge durch chemische Synthese erreicht. L{\"a}ngere modifizierte RNA Molek{\"u}le werden m{\"u}hsam durch Ligation mehrerer Str{\"a}nge synthetisiert. Eine andere M{\"o}glichkeit besteht darin, native RNAs durch in situ Hybridisierung zu markieren. Keine Methode steht somit zur Verf{\"u}gung, um in vitro Transkripte oder native RNAs intern und kovalent zu modifizieren. Ein synthetisches Substrat konnte ohne Ausbeuteverluste mit verschiedenen Fluoreszenzmolek{\"u}len, die chemisch in das Reparaturoligonukleotid eingebaut wurden, mit dem Twinribozym markiert werden. Verschiedene Transkripte wurden ebenfalls erfolgreich mit dem Twinribozym funktionalisiert. Drei verschiedene Modelle wurden untersucht: die Markierung der Transkripte resultierte entweder in einer Verl{\"a}ngerung um vier Nukleotide, in der Einf{\"u}hrung von drei Einzelbasenmutationen oder in gar keinem Sequenzunterschied. Um die Ribozymzug{\"a}nglichkeit der Zielsequenzen zu verbessern wurden erh{\"o}hte Temperaturen sowie DNA Oligonukleotide verwendet, die an das Transkript im Bereich der Flanken zur Ribozymbindungssequenz binden. Markierungsausbeuten von jeweils 53, 47 und 11 \% wurden erzielt. Die potentielle Anwendung von Twinribozymen f{\"u}r die therapeutische RNA Reparatur erfordert eine effektive Zellaktivit{\"a}t. In vitro Versuche konnten zeigen, dass Twinribozyme unter zell{\"a}hnlichen Bedingungen aktiv sind. Ein Versuch, die bestehende in vitro Reaktion in menschlichen Zellkulturen durchzuf{\"u}hren und das Reparaturprodukt nach Zelllyse nachzuweisen, scheiterte, da das Ribozym w{\"a}hrend der Analyse nicht deaktiviert werden konnte. Weiter wurde ein Luciferasereportergen durch die Einf{\"u}hrung verschiedener Mutationen so deaktiviert, dass ein neues entwickeltes Twinribozym die Fehler auf mRNA Ebene reparieren sollte. In vitro Versuche mit kurzen synthetischen Substraten zeigten, dass das Ribozym die Fehler effizient prozessiert. Reparaturans{\"a}tze mit den mutierten Transkripten lieferten aber Reparaturausbeuten unter 1 \%, m{\"o}glicherweise wegen der schlechten Ribozymzug{\"a}nglichkeit der langen Transkripten. Durch Lumineszenzzellversuche konnte leider keine RNA Reparatur nachgewiesen werden. Twinribozyme erlauben den Austausch kurzer RNA Fragmente innerhalb synthetischer RNAs und Transkripte und akzeptieren dabei modifizierte Sequenzen. Dies {\"o}ffnet Twinribozymen den Weg als molekulares Werkzeug f{\"u}r die RNA Reparatur und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung. Die Erarbeitung von M{\"o}glichkeiten, die schlechte Zug{\"a}nglichkeit der Zielsequenzen zu umgehen, sowie der Erhalt positiver Zellversuche werden {\"u}ber die Verwendung dieses potentialreichen RNA Werkzeugs entscheiden.},
  language  = {de}
}