@phdthesis{Doroshenko2007,
  author    = {Elena Doroshenko},
  title     = {Ver{\"a}nderungen des Aktin-Zytoskeletts in CD2AP-defizienten Podozyten},
  journal    = {Alteration of the actin cytoskeleton in CD2AP-deficient podocytes},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000359-8},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die Podozyten bilden mit ihren Aktin-reichen, interdigitierenden Fu{\"s}forts{\"a}tzen und mit Schlitzmembran die entscheidende Einheit der glomerul{\"a}ren Filtrationsbarriere. Verschiedene St{\"o}rungen der Podozytenfunktion bewirken chronische Nierenerkrankungen, darunter die fokal segmentale Glomerulosklerose. M{\"a}use, die keine Expression des 80 kDa-Proteins CD2AP in den Podozyten aufweisen, entwickeln auf noch ungekl{\"a}rte Weise eine progrediente und in nur sechs Wochen post partum letal endende Niereninsuffizienz mit Proteinurie. Histopathomorphologisch l{\"a}sst sich ein Verlust der Podozyten-Fu{\"s}forts{\"a}tze sowie eine Glomerulosklerose nachweisen. Auch beim Menschen sind Mutationen von CD2AP mit einer Glomerulosklerose assoziiert. CD2AP ist ein Docking-Protein der CMS/CIN85-Familie. Mit seinen drei SH3-Dom{\"a}nen, seiner Prolin-reichen Region und weiteren Bindungsstellen ist CD2AP in der Lage, mit einer Vielzahl von Proteinen zu interagieren. Eine Gruppe der Interaktionspartner von CD2AP bilden F-Aktin und Aktin-assoziierte Proteine. Da wir in vorangehenden Arbeiten zeigen konnten, dass CD2AP in kultivierten Podozyten an hochdynamischen F-Aktin-Spots lokalisiert ist (Welsch et al. 2001; Welsch et al. 2005), war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, zu kl{\"a}ren, ob CD2AP an der Regulation der Aktin-Dynamik in den Podozyten beteiligt ist. Zu diesem Zweck wurde das Aktin-Zytoskelett von kultivierten Podozyten aus CD2AP-Knockout-M{\"a}usen im Vergleich zu kultivierten Wildtyp-Podozyten untersucht. Es zeigte sich, dass CD2AP-/--Podozyten deutliche phenotypische Ver{\"a}nderungen im F-Aktin-Zytoskelett gegen{\"u}ber Wildtyp-Podozyten aufweisen. So besitzen CD2AP-/--Podozyten eine polygonale Zellmorphologie aufgrund fast fehlender Lamellipodia sowie vermehrt F-Aktin-Spots, F-Aktin-Stress-Fasern und damit auch gr{\"o}{\"s}ere Fokaladh{\"a}sionen. Neben den zun{\"a}chst beobachteten strukturellen Ver{\"a}nderungen des Aktin-Zytoskeletts fanden sich auch deutliche Ver{\"a}nderungen in der Aktin-Dynamik. So erfolgt der Abbau des Aktin-Zytoskeletts in CD2AP-/--Podozyten nach der Inhibierung der Plus-Enden der Aktin-Filamente mit Cytochalasin D verlangsamt und inkomplett. Ein morphologisch nicht unterscheidbarer inkompletter Abbau des Aktin-Zytoskeletts konnte durch Inhibierung der Aktomyosin-ATPase-Aktivit{\"a}t mittels Blebbistatin in den Wildtyp-Zellen erzeugt werden, was auf eine m{\"o}gliche Interaktion zwischen CD2AP und Myosin II hinweist. Unter Verwendung der FRAP-Technik konnte in GFP-Aktin-transfizierten CD2AP-/-- und Wildtyp-Podozyten der Umsatz von Aktin bestimmt werden. Hierbei zeigte sich, dass CD2AP-/-- und Wildtyp-Podozyten keine unterschiedlichen Aktin-Umsatzgeschwindigkeiten besitzen. Durch Stimulation mit Epidermal Growth Factor k{\"o}nnen in den Podozyten ringf{\"o}rmige hochdynamische Aktin-Strukturen, sogenannte RiLiS (Ring-Like Structures), hervorgerufen werden. In CD2AP-/--Podozyten war die Bildung und die Motilit{\"a}t von RiLiS erheblich vermindert. Durch Transfektion der CD2AP-/--Podozyten mit GFP-CD2AP konnte die Bildung und Motilit{\"a}t der RiLiS wiederhergestellt werden. Die Hemmung der Aktomyosin-ATPase mit Blebbistatin sowie die Hemmung der PI3-Kinase mit Wortmannin oder LY294002 blockierten die Bildung von RiLiS, wobei nur die Hemmung der PI3-Kinase mit einer Motilit{\"a}tsverminderung einherging. Messungen der Phosphorylierung von AKT und ERK nach Stimulation mit EGF zeigten jedoch eine unverminderte Aktivierung der beiden Signalwege in CD2AP-/--Podozyten. Auch eine verminderte Bildung von PIP3 in den RiLiS konnte durch Fluoreszenzintensit{\"a}tsmessungen mit PIP3-bindenden GFP-PH-Fusionsproteinen ausgeschlossen werden. Die C-terminale H{\"a}lfte von CD2AP enth{\"a}lt eine putative F-Aktin-Bindungsstelle und Bindungsstellen f{\"u}r Aktin-assoziierte Proteine. Die Expression eines GFP-Fusionsproteins der C-terminalen H{\"a}lfte von CD2AP (GFP-?N-CD2AP, AS 325-637) war ausreichend, um eine Lokalisation des Konstrukts in den RiLiS zu erreichen, w{\"a}hrend ein GFP-Fusionsprotein der N-terminalen H{\"a}lfte von CD2AP keine Anreicherung in den RiLiS zeigte. GFP-DN-CD2AP war ebenfalls in der Lage die Bildung und Motilit{\"a}t von RiLiS in den CD2AP-/--Podozyten wiederherzustellen. Die schrittweise Verk{\"u}rzung des GFP-DN-CD2AP-Konstrukts am C-terminalen-Ende zeigte, dass die Prolin-reiche Region von CD2AP (AS 325-424) zusammen mit dem Bereich zwischen den Aminos{\"a}uren 424-505 f{\"u}r die Bildung und Motilit{\"a}t der RiLiS essenziell ist. Das Konstrukt, das nur noch die Prolin-reiche Region von CD2AP enthielt, verminderte die Bildung und Motilit{\"a}t der RiLiS im Sinne eines dominant-negativen Effektes. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit erstmals, dass CD2AP in den Podozyten bei der Regulation der Aktin-Dynamik eine nicht-redundante Funktion besitzt. Der Bereich von CD2AP, der die Bindungsstellen f{\"u}r F-Aktin und Aktin-assoziierte Proteine enth{\"a}lt, spielt f{\"u}r die Aus{\"u}bung dieser Funktion eine entscheidende Rolle},
  language  = {de}
}