@phdthesis{Rimmbach2009,
  author    = {Christian Rimmbach},
  title     = {Untersuchungen zur Funktion von Isoformen pharmakologisch relevanter Signalproteine durch RNA Interferenz},
  journal    = {Functional analysis of pharmacological important isoforms of signal proteins with RNA interference},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000622-7},
  year      = {2009},
  abstract  = {Das Das Verst{\"a}ndnis zellul{\"a}rer Signaltransduktionswege ist ein zentrales pharmakologisches Forschungsthema. Dabei ist die Interaktion von Arzneimitteln mit Rezeptorproteinen, entweder als Agonisten oder Antagonisten, essentiell f{\"u}r die Wirkung vieler Arzneimittel. Die Aufkl{\"a}rung der sich daran anschlie{\"s}enden Signaltransduktionswege ist f{\"u}r das molekulare Verst{\"a}ndnis vieler Arzneimittelwirkungen deshalb von besonderem Interesse. Viele Forschungsanstrengungen in der Vergangenheit haben sich intensiv mit der Aufkl{\"a}rung solcher Signaltransduktionsvorg{\"a}ngen besch{\"a}ftigt. W{\"a}hrend die Grundz{\"u}ge solcher Signalwege h{\"a}ufig sehr gut erforscht sind, f{\"a}llt auf, dass von vielen Signalproteinen zahlreiche Isoformen existieren, die vermutlich am Zustandekommen von Rezeptor-und Effektorspezifit{\"a}ten beteiligt sind und h{\"a}ufig gewebespezifisch exprimiert werden. {\"U}ber die Bedeutung solcher Isoformen – insbesondere f{\"u}r Signaltransduktionsvorg{\"a}nge in vivo – ist wenig bekannt. So kennt man 5 G-Protein beta-Untereinheiten und 12 G-Protein gamma- Untereinheiten, die spezifischen Funktionen bleiben aber offen. {\"A}hnliches gilt f{\"u}r das Netzwerk von PLC-Isoformen, wobei die Entdeckung der PLC epsilon und weiterer Isoformen darauf hindeutet, dass es hier zeitliche und r{\"a}umliche Integrationsfunktionen der neu entdeckten Mitglieder gibt. Wesentliche Elemente der durch die PLC vermittelten Signaltransduktion sind die Spaltung von PIP2 in DAG und IP3 sowie der tempor{\"a}re Anstieg der [Ca2+]i. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Etablierung und Adaptation eines Systems zur retroviralen Infektion von Zellen mit siRNA-Molek{\"u}len angestrebt, die in der Generierung stabiler knock down Zellen resultieren sollte. Im zweiten Schritt sollte diese Technik auf Fragestellungen zur Gbeta-Protein Spezifit{\"a}t und des PLC-Netzwerkes angewendet werden. Bei der RNA-Interferenz (RNAi) handelt es sich um einen hochkonservierten posttranskriptionellen Mechanismus zur Regulation der Genexpression in eukaryotischen Zellen. Eine zentrale Rolle in der RNAi spielen kurze RNA-Molek{\"u}le wie siRNAs und miRNAs. Es wurde ein retroviral basiertes Expressionssystem zur siRNA-Expression erstellt und validiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses System erfolgreich zum knock down der Expression von PLCbeta1 PLCbeta 3, PLC epsilon, Gbeta1, Gbeta2 und Gbeta5 eingesetzt. Au{\"s}erdem wurde mit Hilfe dieses Systems ein erfolgreicher knock down der Expression von Epac1 (Lopez De Jesus et al., 2006), von Cathepsin B (Dr. Bien, pers{\"o}nliche Mitteilung) und MRP5 (multidrug resistance related protein 5; Nambaru, H{\"u}bner, K{\"o}ck, Jedlitschky, Rimmbach, Rosskopf, Kroemer, Weiss, Mayerle, Lerch, und Ritter: Modulation of drug efflux transporter MRP5 affects sensitivity to the nucleoside anticancer drug 5-fluorouracil in pancreatic cancer cell lines; Molecular Cancer Therapeutics; eingereicht) durchgef{\"u}hrt. Wesentliche Befunde zur spezifischen Signal{\"u}bertragung dieser Arbeit waren die Beobachtung, dass der knock down von Gbeta 1 keinen Einfluss auf die Signal{\"u}bertragung der Transmitter Bradykinin und Histamin besitzt. Die funktionelle Ausschaltung von Gbeta 2 oder Gbeta 5 – zweier Gbeta-Untereinheiten, die zu unterschiedlichen Gbeta-Familien geh{\"o}ren – f{\"u}hrte jedoch zu einer signifikanten Hemmung dieser Signale. Es handelt sich bei dieser Beobachtung um einen der wenigen Befunde, die eine Spezifit{\"a}t bei der Gbeta-vermittelten Signaltransduktion herausarbeiten k{\"o}nnen. Auf {\"a}hnliche Weise konnte plausibel gemacht werden, dass die PLCbeta3 – nicht aber die PLCbeta1 – an der Signal{\"u}bertragung von LPA-Rezeptoren beteiligt ist. Ein funktioneller knock down der PLC epsilon wirkte sich nicht auf die fr{\"u}hen Calciumsignale nach Stimulation von GProtein- gekoppelten Rezeptoren f{\"u}r LPA, S1P oder Acetylcholin aus. Interessanterweise waren aber nach Ausschaltung der PLC epsilon Calciumsignale, die durch den EGF-Rezeptor – einer Rezeptortyrosinkinase – vermittelt wurden stark gehemmt. Bei der Analyse des Zeitverlaufs der durch LPA stimulierten Calciumsignale fiel ferner auf, dass eine l{\"a}nger anhaltende Plateauphase in Abwesenheit der PLC epsilon unterblieb. Dies deutet auf eine Integrationsfunktion der PLC epsilon in sp{\"a}teren Phasen der Signal{\"u}bertragung hin, die zu einem anhaltenden Anstieg der Ca2+-Konzentration beitr{\"a}gt. Es ist bekannt, dass diese Anstiege z.B. bei der Proliferationskontrolle eine wichtige Rolle spielen. Im Einklang mit diesen Befunden fiel auf, dass nach Stimulation mit dem Lysolipid LPA die Proliferationsrate von PanC1 Pankreaskarzinomzellen, denen die PLC epsilon durch retroviralen Transfer von siRNA Molek{\"u}len ausgeschaltet wurde, signifikant erniedrigt war. Schlie{\"s}lich wurde eine neue Methode zur Quantifizierung von Transkriptmengen homologer Transkripte basierend auf dem Pyrosequencing Verfahren etabliert und validiert. Gerade bei hoch homologen Genen – wie es bei Gbeta -Untereinheiten der Fall ist – kann diese Methode der relativen Quantifizierung sehr gut eingesetzt werden, da im Gegensatz zu anderen Techniken, die wesentlichen Messungen in einem Ansatz durchgef{\"u}hrt werden k{\"o}nnen. Abschlie{\"s}end bleibt festzuhalten, dass es gelungen ist, die innovative Technik der RNA Interferenz auf Fragen der Signal{\"u}bertragung unter Verwendung retroviraler Infektionstechniken anzuwenden. In ersten Experimenten konnten bereits bislang unbekannte Spezifit{\"a}ten bei der Signal{\"u}bertragung {\"u}ber heterotrimere G-Proteine bzw. PLC-Isoformen heraus gearbeitet werden. Damit ist der Grundstein f{\"u}r zuk{\"u}nftige systematische Analysen dieser Zusammenh{\"a}nge mit Hilfe der hier etablierten Techniken gelegt.},
  language  = {de}
}