@phdthesis{Draheim2010,
  author    = {Viola Draheim},
  title     = {In vitro-Modell zur Charakterisierung transportvermittelter bili{\"a}rer Ausscheidung},
  journal    = {In vitro model for the characterization of transport-mediated biliary excretion},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000768-5},
  year      = {2010},
  abstract  = {Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobili{\"a}re Elimination nimmt eine Schl{\"u}sselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobili{\"a}r eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singul{\"a}re Substanzeffekte auf zellul{\"a}rer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen k{\"o}nnen zu erheblichen Nebenwirkungen durch Ver{\"a}nderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erh{\"o}hter oder eingeschr{\"a}nkter Bioverf{\"u}gbarkeit f{\"u}hren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, f{\"u}r die fr{\"u}he Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobili{\"a}rer Elimination auf indirektem Weg {\"u}ber die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten erm{\"o}glicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierf{\"u}r war es zun{\"a}chst unerl{\"a}sslich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass prim{\"a}re Hepatozyten nur bef{\"a}higt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-{\"a}hnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellul{\"a}ren Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierf{\"u}r als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollst{\"a}ndigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgew{\"a}hlte Transportproteine und Cytochrome umfassend, {\"u}ber einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validit{\"a}t des Zellsystems zu gew{\"a}hrleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erh{\"o}hung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund f{\"u}r die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, {\"u}ber die Bestimmung der funktionellen Aktivit{\"a}t unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate {\"u}ber einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivit{\"a}t der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Molek{\"u}le in den Lumina der Gallenkan{\"a}lchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verst{\"a}rkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivit{\"a}t der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und best{\"a}tigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abh{\"a}ngigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellul{\"a}ren Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivit{\"a}t konzentrationsabh{\"a}ngig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren war. Dies konnte mittels des Zelltoxizit{\"a}tsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgem{\"a}{\"s} auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der fr{\"u}hen Arzneistoffentwicklung k{\"o}nnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuw{\"a}hlen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobili{\"a}ren Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.},
  language  = {de}
}