@phdthesis{Hesseler2012,
  author    = {Martin Hesseler},
  title     = {Protein Engineering und Anwendung von Enzymen mit α/β-Hydrolasefaltung},
  journal    = {Protein Engineering and Application of Enyzmes with the α/β-Hydrolase Fold},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001164-6},
  year      = {2012},
  abstract  = {In ersten Teil der Arbeit wurde versucht, in einer α/β-Hydrolase (Esterase) durch den Austausch einzelner Aminos{\"a}uren die Aktivit{\"a}t eines anderen Mitgliedes zu erzeugen (Haloalkan-Dehalogenase (HLD)). Als Modellenzym diente die Arylesterase PFE aus Pseudomonas fluorescens, welche wie die HLDs eine cap-Dom{\"a}ne aus \&alhpa;-Helices aufweist. Bei den HLDs wurde sich an den Unterfamilien HLD-I und II orientiert, deren Mitglieder Unterschiede in ihren katalytischen Triaden und in einigen weiteren, an der Katalyse beteiligten Aminos{\"a}uren zeigen. Sie katalysieren jedoch die gleiche Reaktion und unterscheiden sich nicht in ihrem Mechanismus. Mit Hilfe von Sequenz- und Strukturalignments einiger HLDs und der PFE wurde nach konservierten Bereichen innerhalb der HLDs gesucht. Neben der katalytischen Triade mussten die f{\"u}r HLD-Aktivit{\"a}t essenziellen Halogen-stabilisierenden Reste in der PFE eingef{\"u}gt werden. Sowohl in der katalytischen Triade als auch bei den Halogen-stabilisier enden Resten gibt es Unterschiede zwischen den Unterfamilien HLD-I und HLD-II, woraus sich zwei unterschiedliche S{\"a}tze von hotspots ergaben. Mit Hilfe der error-prone PCR wurden auf Basis einer einfachen Mutante 4.000 Varianten erstellt und analysiert. Ein weiterer Ansatz zur Generierung von HLD-Aktivit{\"a}t beruhte auf einer S{\"a}ttigungsmutagenese der Halogen-stabilisierenden Reste. Insgesamt wurden in diesem Experiment 765 Varianten erstellt und untersucht. Keine der mittels rationalem Design und gerichteter Evolution entwickelten Mutanten zeigte Aktivit{\"a}t. Das Fehlen von HLD-Aktivit{\"a}t liegt vermutlich im variabelsten Teil der HLDs begr{\"u}ndet: dem loop nach dem β6-Strang. Die Aminos{\"a}uren aus diesem loop sind an der Bildung der Tunnel zum aktiven Zentrum beteiligt und haben Einfluss auf die Positionierung der Reste in der α4-Helix, welche z.T. das aktive Zentrum dieser Enzyme bilden. Der zweite Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens zum Abbau von 3-Chlor-1,2-Propandiol (3-MCPD) und seinen Estern, welche in Lebensmitteln bei deren Herstellung entsehen k{\"o}nnen. Das Verfahren basiert auf einer Enzymkaskade aus Lipase, Haloalkohol-Dehalogenase (HHD) und Epoxydhydrolase (EH). Die Lipase setzt zun{\"a}chst den Ester um und somit das 3-MCPD frei, welches im n{\"a}chsten Schritt von der HHD zu Glycidol umgesetzt wird. Das ebenfalls toxische Glycidol wird schlie{\"s}lich durch eine EH zum nicht-toxischen Glycerin hydrolisiert. Im konkreten Fall wurden die Lipase A aus Candida antarctica (CAL-A), die HHD HheA aus Arthrobacter sp. AD2 und die EH EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1 verwendet. Als Fetts{\"a}urekomponente f{\"u}r die Ums{\"a}tze mit einem 3-MCPD-Ester wurde die {\"O}ls{\"a}ure gew{\"a}hlt. Im w{\"a}ssrigen System konnten innerhalb von 3,5 h 75\% des 3-MCPD umgesetzt werden, wobei nach Beendigung der Reaktion das Zwischenprodukt Glycidol nicht mehr detektiert werden konnte. Im 2-Phasen-System mit dem 3-MCPD-{\"O}ls{\"a}ureester als Substrat war die Lipase CAL-A in der Lage, den Ester nahezu quantitativ aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen und die entsprechenden Mengen an 3-MCPD freizusetzen, welches dann in der w{\"a}ssrigen Phase durch die HHD und die EH umgesetzt wurde. Dabei konnte der Wassergehalt im System ohne Einbu{\"s}en in der Effektivit{\"a}t bis auf 5\% gesenkt werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine neue HLD (DppA) aus Plesiocystis pacifica SIR-1 identifiziert und charakterisiert. Sequenz- und Strukturanalysen erlaubten die Einordnung des Proteins in die HLD-Unterfamilie I. Nach Untersuchung der Substratspezifit{\"a}t von DppA wurde das Enzym der Spezifit{\"a}tsgruppe SSG-I zugeordnet. Im Unterschied zu den anderen Mitgliedern dieser Gruppe setzte DppA allerdings keines der getesteten chlorierten Substrate um. Bei der Suche nach strukturellen Erkl{\"a}rungen f{\"u}r diese Tatsache fiel eine L{\"u}cke im Sequenzalignment von DppA und dessen n{\"a}chsten Verwandten DhlA auf. DppA fehlt hier ein Bereich von 11 Aminos{\"a}uren. Der Bereich liegt in der cap-Dom{\"a}ne und es wurde postuliert, dass das betreffende Segment sich durch die Anpassung eines Vorfahren heutiger Dehalogenasen an das Substrat 1,2-Dichlorethan entwickelte. In einer darauffolgenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass DhlA nach Entfernen einer Kopie der Sequenzwiederholungen nicht mehr in der Lage war, sein nat{\"u}rliches Substrat 1,2-Dichlorethan umzusetzen, daf{\"u}r aber immer noch Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber 1,2-Dibromethan zeigte. Die Aminos{\"a}urereste der Wiederholungen in DhlA haben Einfluss auf die Positionierung sowohl von Tunneln als auch von Resten im aktiven Zentrum. Ein Alignment der Strukturen von DhlA und DppA zeigte, dass ein Teil der Sequenz die Postion des slot-Tunnels aus DppA blockiert. Dementsprechend befindet sich dieser Tunnel in DhlA auch an anderer Stelle. Dem Enzym fehlen die mit der F{\"a}higkeit zur Umsetzung von 1,2-Dichlorethan in Verbindung gebrachten Sequenzwiederholungen und dementsprechend setzt es insbesondere dieses Substrat nicht um.},
  language  = {de}
}