@phdthesis{Hasenpusch2011,
  author    = {Daniel Hasenpusch},
  title     = {Theoretische Untersuchungen zur Struktur und zum Reaktionsmechanismus der Schweineleberesterase und ihrer Isoenzyme},
  journal    = {Theoretical investigations on the structure and the reactional mechanism of the pig liver esterase and its isoenzymes},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001034-9},
  year      = {2011},
  abstract  = {Es wurden theoretische Untersuchungem zu sieben verschiedenen Isoenzymen der Schweineleberesterase vorgenommen. Vorhersagen zur Struktur wurden molek{\"u}ldynamisch mit Hilfe eines Kraftfeldprogramms (AMBER-Paket) durchgef{\"u}hrt. Der Reaktionsmechanismus wurde quantenchemisch (CPMD), sowie mit einer Hybridmethode (QM/MM) nachvollzogen. Da keine Kristallstruktur vorhanden ist, wurde auf ein Homologiemodell aus eigenen Vorarbeiten zur{\"u}ckgegriffen. Mit Kraftfeldberechnungen wurden die einzelnen Monomere f{\"u}r etwa 10 bis 14 ns simuliert. Dabei zeigte sich eine Relaxation der Enzyme nach 8 bis 10 ns. In jedem Fall wurden stabile Endstrukturen der Monomere (um die 8000 Atome plus etwa 40000 Wassermolek{\"u}le) gefunden. Am Beispiel der PLE3 wurde sogar eine partielle Entfaltung der Eingangshelix beobachtet, die in einer R{\"u}ckmutation nicht wiederherstellbar war. Andererseits wurde bei der PLE1 die spontane Ausbildung einer 3-10-Helix in der N{\"a}he der Eingangshelix gefunden. Es wurden auch stabile Endstrukturen der Trimere (um die 24000 Atome plus etwa 50000 Wassermolek{\"u}le) gefunden. Interaktionen zwischen den Monomeren wurden beobachtet, die nach 14 bis 18 ns stabil zusammenlagen. Es konnten {\"u}ber RMSD-Auswertungen starre und flexible Bereiche innerhalb der Isoenzyme als auch zwischen den einzelnen identifiziert werden. Die starren Bereiche stimmen sehr gut mit dem Faltungsmotiv der a/b-Hydrolasen {\"u}berein. Spezifische Abst{\"a}nde des aktiven Zentrums wurden w{\"a}hrend der klassisch simulierten Molek{\"u}ldynamiken {\"u}berpr{\"u}ft. Dabei war es nicht m{\"o}glich, mit dem in der Literatur propagierten katalytischem Glutamat Abst{\"a}nde in der Gr{\"o}{\"s}enordnung einer Wasserstoff-br{\"u}cke zu erhalten. Vielmehr wurde eine g{\"u}nstige und stabile Lage eines anderen Glutamats gefunden, wodurch sich aber nichts am allgemeinen Reaktionsmechanismus {\"a}ndert. Die Zugangswege wurden durch gezwungenes Ziehen der Molek{\"u}le aus der L{\"o}sung ins aktive Zentrum beobachtet und {\"u}ber Kraft-Weg-Kurven ausgewertet. In Simulationen im Nanosekundenbereich konnte auch freiwilliges Eindringen der Substratmolek{\"u}le ins Enzym beobachtet werden, wobei dieser Vorgang von der Gr{\"o}{\"s}e des Molek{\"u}ls abh{\"a}ngt. Die bei den unterschiedlichen Simulationen gefundenen Taschen sind f{\"u}r jedes Substrat verschieden, obwohl die beteiligten Aminos{\"a}uren die jeweiligen Substratmolek{\"u}le fest umschlie{\"s}en. Dieses Anpassen der Taschen an das jeweilige Substrat passt zu dem induced-fit-Modell. W{\"a}hrend das spontane Eindringen der Substratmolek{\"u}le innerhalb weniger Nanosekunden erfolgte, konnte erst nach einer Simulationszeit von 25 ns ein Verlassen von Methanol aus dem Enzym beobachtet werden. Mit quantenchemischen Berechnungen im Picosekundenbereich, unter Ber{\"u}cksichtigung der neuen Zuordnung des katalytischen Glutamats, konnte der gesamte Reaktionsmechanismus dargestellt werden. Am Beispiel des Methylbutyrats wurden die Bildung des ersten tetraedrischen Intermediats, sowie die anschlie{\"s}enden Abspaltungen des Alkohols und der S{\"a}ure, mit Hilfe von Constraints dargestellt. Die durch die Mutationen hervorgerufenen strukturellen Ver{\"a}nderungen der Isoenzyme insbesondere der Eingangshelix k{\"o}nnen f{\"u}r die unterschiedlichen Enantioselektivit{\"a}tswerte verantwortlich sein. Eine Verantwortlichkeit von Taschen f{\"u}r die verschiedenen Enantioselektivit{\"a}ten ist aufgrund der gefundenen weichen Struktur um die Substrate mit jeweils unterschiedlich beteiligten Aminos{\"a}uren nicht erkennbar.},
  language  = {de}
}