@phdthesis{Olzhausen2012,
  author    = {Judith Olzhausen},
  title     = {Genetische Analyse und metabolische Deregulation der Coenzym A-Biosynthese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae},
  journal    = {Genetic analysis and metabolic engineering of the coenzyme A-biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001256-5},
  year      = {2012},
  abstract  = {Coenzym A ist ein essentieller und ubiquit{\"a}rer Cofaktor, dessen zentrale Bedeutung f{\"u}r den Stoffwechsel aus der Aktivierung und {\"U}bertragung von Acylgruppen resultiert. Der Biosyn-theseweg von Coenzym A (CoA) ausgehend von Pantothenat (Pan) umfasst f{\"u}nf enzymatische Schritte, die in Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Die Hefe S. cere¬visiae ist in der Lage, sowohl eine de novo Pantothenat-Synthese durchzuf{\"u}hren als auch mittels Fen2-Transporter dieses Intermediat aufzunehmen. Die Phosphorylierung von Pan durch die Pantothenat Kinase (PanK) stellt vermutlich den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dar, der in Form einer Inhibition durch das Endprodukt bzw. dessen Derivate erfolgt. Ziel dieser Arbeit sollte es sein, grundlegende Erkenntnisse zu den Enzymen des CoA-Biosyntheseweges, deren Organisation und Regulation in der Hefe zu bekommen. Durch „metabolic engineering“ sollte versucht werden, einen Stamm zu konstruieren, der im Vergleich zu einem Wildtyp einen erh{\"o}hten CoA-Gehalt aufweist. F{\"u}r das Genprodukt von YDR531W in S. cerevisiae konnte aufgrund der Verwertbarkeit von 14C-Pantothenat als Substrat die Vermutung best{\"a}tigt werden, dass es sich um eine PanK handelt, so dass dieses Gen die neue Bezeichnung CAB1 („Coenzym A Biosynthese“) erhielt. Es erfolgt eine „Feedback“-Inhibition durch CoA und in st{\"a}rkerem Ma{\"s}e durch dessen Thioester Acetyl-CoA. Der Einfluss von Malonyl-CoA und Palmitoyl-CoA auf die Aktivit{\"a}t der PanK ist vernachl{\"a}ssigbar. Durch gerichtete Mutagenese konnte eine Acetyl-CoA insensitive deregulierte PanK-Variante CAB1W331R erzeugt werden, die, verglichen mit dem Wildtyp, eine etwa vierfach gesteigerte Aktivit{\"a}t aufweist. F{\"u}r die vier weiteren Gene YIL083C, YKL088W, YGR277C und YDR196C, die aufgrund von {\"A}hnlichkeiten zu humanen CoA-Genen identifiziert wurden, konnte der Nachweis erbracht werden, dass es sich um CoA-Biosynthesegene handelt. Eine Nullmutation in jedem dieser essentiellen Gene lie{\"s} sich durch das entsprechende E. coli Gen, f{\"u}r die der enzymatische Nachweis der Genprodukte vorliegt, heterolog komplementieren. Folgende neue Genbe-zeichnungen wurden aufgrund der Abfolge der Reaktionsschritte vergeben: YIL083C = CAB2 (codiert f{\"u}r die Phosphopantothenyl Cystein Synthetase, PPCS), YKL088W = CAB3 (Phosphopantothenylcystein Decarboxylase, PPCDC), YGR277C = CAB4 (Phosphopante-thein Adenyltransferase, PPAT) und YDR196C = CAB5 (Dephospho-CoA.Kinase, DPCK). F{\"u}r CAB1, CAB2 und CAB5 war ein moderater Anstieg der Genexpression zu beobachten, wenn Glucose durch Ethanol als C-Quelle ersetzt wurde. Die Abwesenheit von Aminos{\"a}uren beeinflusste die Expression der CAB Gene kaum. Mit Hilfe chromatographischer Reinigungsschritte war eine Cofraktionierung der epitopmar-kierten Proteine Cab3 und Cab5 m{\"o}glich, die einen ersten Hinweis auf die Existenz eines CoA-synthetisierenden Enzymkomplexes (CoA-SPC) lieferten. Dessen durch Gelfiltration bestimmte Gr{\"o}{\"s}e betr{\"a}gt ungef{\"a}hr 327 kDa. In vitro-Interaktionsstudien ergaben, dass Cab1 (PanK) nicht an der Bildung dieses Komplexes beteiligt ist und dass Cab2, Cab3, Cab4 und Cab5 mit Cab3 interagieren. Weiterhin konnten Wechselwirkungen zwischen Cab4 und Cab5 nachgewiesen werden. Durch Konstruktion von L{\"a}ngenvarianten der genannten Proteine wurden die f{\"u}r die Interaktionen jeweils verantwortlichen Proteinabschnitte kartiert. Vermutlich dient Cab3 als zentrales „Ger{\"u}stprotein“ des gesamten CoA-SPC-Komplexes. Mit ausschlie{\"s}lich bakteriell synthetisierten Proteinen konnte zumindest f{\"u}r Cab3 gezeigt werden, dass die Interaktionen direkt erfolgen. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, durch {\"U}berexpression der CoA-Bio-synthesegene die zellul{\"a}re CoA-Synthese zu beeinflussen. Mit Hilfe integrativer Plasmide wurden MET25-Promotor-kontrollierte {\"U}berexpressionskassetten aller CAB-Gene sukzes¬sive in einen Wildtypstamm eingef{\"u}hrt. F{\"u}r das Gen der PanK wurde das Wildtyp-Allel CAB1 bzw. die deregulierte Variante CAB1W331R verwendet. Einen Unterschied zwischen den St{\"a}mmen konnte f{\"u}r den Acetyl-CoA-, allerdings nicht f{\"u}r den CoA-Gehalt gemessen werden. {\"U}berexpressionsst{\"a}mme mit der regulierten PanK bzw. der deregulierten PanK-Variante enthielten im Vergleich zum Wildtyp die 3-fache bzw. sogar die 6-fache Menge an Acetyl-CoA. Dieser Befund belegt die Schrittmacherfunktion der PanK f{\"u}r den gesamten CoA-Biosyntheseweg.},
  language  = {de}
}