@phdthesis{Hummel2013,
  author    = {Anke Hummel},
  title     = {Das Metagenom als Quelle neuer oxidativer Enzyme f{\"u}r die Biotechnologie},
  journal    = {The metagenome as source of novel oxidative enzymes for biotechnology},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001415-2},
  year      = {2013},
  abstract  = {Der Einsatz von Enzymen ist inzwischen f{\"u}r viele Bereiche der chemischen und pharmazeutischen Industrie beschrieben. Dabei erm{\"o}glichen die Enzyme als Biokatalysatoren in vielen F{\"a}llen Syntheserouten, die umweltvertr{\"a}glichere Wege zum gew{\"u}nschten Produkt darstellen als die vergleichbaren etablierten chemischen Routen. Insbesondere ihre oft stereo-, regio- und chemoselektiven Ums{\"a}tze er{\"o}ffnen Zugang zu wichtigen pharmazeutisch relevanten Produkten und Zwischenprodukten. Nach wie vor gibt es aber in vielen Enzymklassen Bedarf nach neuen oder verbesserten Enzymen. Insbesondere bei den oxidativen Enzymen erf{\"u}llen die zur Zeit vorhandenen Biokatalysatoren oftmals nicht die Anforderungen hinsichtlich Aktivit{\"a}t, Stabilit{\"a}t oder Selektivit{\"a}t. Das Auffinden neuer Biokatalysatoren, die eine Transformation von chemokatalysierten zu enzymatischen Prozessen erm{\"o}glichen, stellt die Motivation f{\"u}r die vorliegende Arbeit dar. Um Zugang zu neuen Enzymen zu erlangen, bestehen die klassischen Wege in einer Anreicherungskultur aus einer Umweltprobe und der nachfolgenden Isolierung von Organismen mit der gew{\"u}nschten Enzymaktivit{\"a}t, oder in der Suche in einer bereits angelegten Stammsammlung. Die meisten Mikroorganismen k{\"o}nnen jedoch unter Laborbedingungen nicht kultiviert werden. Der Metagenom-Ansatz {\"o}ffnet den Zugang zu eben diesen Enzymen. Dazu wird der Kultivierungsschritt umgangen und die DNA der Umweltprobe direkt isoliert. Diese metagenomische DNA kann anschlie{\"s}end entweder {\"u}ber ein Aktivit{\"a}ts-basiertes oder {\"u}ber ein Sequenz-basiertes Screening auf bestimmte Enzyme hin untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Aktivit{\"a}ts-basierte Ansatz gew{\"a}hlt, da auf diese Weise v{\"o}llig neue Enzyme gefunden werden k{\"o}nnen, die keine Homologie zu bereits beschriebenen aufweisen. Als Grundlage f{\"u}r das Screening wurden metagenomische Bibliotheken aus verschiedenen Umweltproben angelegt. Um die Zahl der zu durchmusternden Klone gering zu halten, wurde ein Gro{\"s}teil der DNA in Cosmide kloniert. Als mikrobieller Wirt f{\"u}r die rekombinante Expression der Proteine wurde Escherichia coli gew{\"a}hlt. Der Prozess des Screenings stellte den wesentlichen Teil der Arbeit dar. Dazu wurden verschiedene Enzymassays adaptiert, um die enzymatisch gebildeten Produkte zu detektieren. In vielen F{\"a}llen wurde dies durch die Bildung farbiger Produkte erm{\"o}glicht, die spektrophotometrisch detektiert werden konnten. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag dabei auf den oxidativen Enzymen, insbesondere den Monooxygenasen. Verschiedene Gruppen von Monooxygenasen wurden dabei betrachtet: Styrol-Monooxygenasen, P450-Monooxygenasen sowie Baeyer-Villiger-Monooxygenasen. Au{\"s}erdem wurden die metagenomischen Bibliotheken auf Oxidasen durchmustert. Neben oxidativen Enzymen wurde nach Transaminasen, Esterasen, Proteasen und Phosphatasen gescreent. Zwei metagenomische Esterasen und drei Phosphatasen konnten auf diese Weise gefunden werden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die unterschiedlichen Wege, {\"u}ber den Aktivit{\"a}ts-basierten Metagenom-Ansatz zu neuen oxidativen Enzymen zu gelangen, ausf{\"u}hrlich diskutiert. Der Fokus lag dabei auf der Wahl der Biotope f{\"u}r das Anlegen der metagenomischen Bibiotheken, den DNA-Isolierungsmethoden sowie der Nachweisempfindlichkeit und Hochdurchsatz-F{\"a}higkeit der verwendeten Assays. Des Weiteren wurde der Zusammenhang zwischen der erwarteten Gr{\"o}{\"s}e der Gene und der durchmusterten Bibliothek diskutiert. Dabei wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass der Metagenom-Ansatz grunds{\"a}tzlich ein gro{\"s}es Potential zur Identifizierung neuer Enzyme f{\"u}r die Biotechnologie birgt, aber Grenzen beim Auffinden gro{\"s}er, komplexer oder seltener Enzyme aufweist.},
  language  = {de}
}