@phdthesis{Matschinski2014,
  author    = {Kathrin Matschinski},
  title     = {Inflammasom - Aktivierung in murinen Makrophagen nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei und deren Bedeutung f{\"u}r die Virulenz},
  journal    = {Activation of the inflammasome in murine macrophages after infection with Burkholderia pseudomallei and its impact on virulence},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001680-8},
  year      = {2014},
  abstract  = {Bei dem gramnegativen Pathogen Burkholderia pseudomallei, auch bekannt als Erreger der ‘Melioidose’, handelt es sich um einen saprophytischen Bodenbewohner, der in den tropischen und subtropischen Regionen S{\"u}dostasiens und Nordaustraliens endemisch verbreitet ist. Als fakultativ intrazellul{\"a}rer Erreger ist B. pseudomallei neben einer Vielzahl nicht phagozytierender Zellen auch in professionellen Phagozyten zur Replikation f{\"a}hig. In Makrophagen sind cytosolische NOD-like Rezeptoren (NLR) als Bestandteil der angeborenen Immunabwehr ma{\"s}geblich an der Erkennung intrazellul{\"a}rer Gefahrensignale beteiligt. Bei entsprechender Signalgebung wird durch Assemblierung eines als ‘Inflammasom’ bezeichneten Multiproteinkomplexes die Rekrutierung und nachfolgende Autoaktivierung von Caspase-1 bewirkt. Nach Infektion mit B. pseudomallei geht die Aktivierung von Caspase-1 in Verbindung mit dem NOD-like Rezeptor Nlrp3 mit der Prozessierung und Sekretion der Cytokine IL-1β und IL-18 einher, wohingegen der Sensor Nlrc4 in erster Linie f{\"u}r die Induktion einer inflammatorischen Form des Zelltodes namens ‘Pyroptose’ verantwortlich ist. Da der Knockout von Caspase-1 bei muriner Melioidose einen signifikanten Anstieg der Mortalit{\"a}tsrate nach sich zieht, sollten in der vorliegenden Arbeit Caspase-1-vermittelte Effektormechanismen gegen{\"u}ber B. pseudomallei n{\"a}her untersucht werden. Infolge der Infektion muriner C57BL/6 Makrophagen mit B. pseudomallei wurde bereits 60 Minuten post infectionem eine Caspase-1 und -9-abh{\"a}ngige Prozessierung von Caspase-7 sowie des DNA-Reparaturenzyms PARP deutlich. Als verantwortlicher Sensor ist hierbei der NOD-like Rezeptor Nlrc4 identifiziert worden. Obwohl in Caspase-1/11 knockout Makrophagen w{\"a}hrend der Fr{\"u}hphase der Infektion keine Spaltprodukte der drei genannten Caspasen vertreten waren, konnte zu sp{\"a}teren Zeitpunkten eine massive Aktivierung der apoptotischen Caspasen-8, -9, -3 und -7 sowie der Stress-induzierten MAP-Kinasen JNK und p38 beobachtet werden. Vergleichende Proteomanalysen B. pseudomallei-infizierter C57BL/6 Makrophagen lie{\"s}en ebenfalls eine verst{\"a}rkte Expression proapoptotischer und proinflammatorischer Signalmolek{\"u}le in Caspasen-1/11-defizienten Makrophagen erkennen. Im Gegensatz dazu wies der Knockout von Caspase-7 nach Infektion mit B. pseudomallei weder in vitro noch in vivo einen charakteristischen Ph{\"a}notyp auf. Im Vergleich zu B. pseudomallei konnte durch die Infektion mit der avirulenten Spezies Burkholderia thailandensis erst bei verh{\"a}ltnism{\"a}{\"s}ig hohen Infektionsdosen eine sichtbare Prozessierung der Caspasen-1, -9 und -7 in C57BL/6 Makrophagen erreicht werden. Dar{\"u}ber hinaus wurde trotz einem mit B. pseudomallei vergleichbaren Replikationsverm{\"o}gen, ein geringeres Ma{\"s} an Pyroptose in B. thailandensis - infizierten Makrophagen nachgewiesen. Zur Identifizierung, welche bakteriellen Komponenten von B. pseudomallei f{\"u}r die Aktivierung von Caspase-1 verantwortlich sind, wurden zwei Deletionsmutanten der Bsa T3SS-Proteine BopE und BsaK hergestellt. Dem Bsa T3SS konnte in vorausgehenden Studien eine wesentliche Funktion f{\"u}r die Virulenz von B. pseudomallei im Tiermodell zugeschrieben werden und dessen Bestandteile weisen Homologien zu den Inv/Mxi-Spa-Sekretionssystemen von S. typhimurium und S. flexneri auf. Die Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 sowie die Spaltung von PARP wurde durch die Infektion muriner Makrophagen mit der Mutante des ‘inner rod proteins’ BsaK vollst{\"a}ndig aufgehoben, wohingegen die Mutagenese des Effektors BopE keinen Einfluss aus{\"u}bte. Neben einer verminderten Freisetzung von LDH und IL-1β konnte dabei auch ein Anstieg der intrazellul{\"a}ren Keimzahl in ΔBsaK-infizierten Makrophagen verzeichnet werden. Demgegen{\"u}ber f{\"u}hrte die Verwendung einer Flagellin-Transposonmutante lediglich zu einer Reduktion der B. pseudomallei-induzierten Prozessierung der Caspase-1, -9 und -7 sowie der Spaltung von PARP. Mittels {\"U}berexpressionsstudien in HEK-293 Zellen konnte ferner die potentielle F{\"a}higkeit des Bsa T3SS-Effektors BopE zur Aktivierung von Caspase-1 in Abh{\"a}ngigkeit von der Funktionalit{\"a}t der BopE-eigenen GEF-Dom{\"a}ne demonstriert werden. In verschiedenen in vivo Experimenten wurde gezeigt, dass ΔBsaK-infizierte BALB/c M{\"a}use im Vergleich zum Wildtyp und in Verbindung mit geringen Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz durch eine signifikant verminderte Mortalit{\"a}tsrate sowie eine Reduktion proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet sind. Insgesamt betrachtet zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass BsaK, als strukturelle Komponente des Bsa Typ-III-Sekretionsapparates, in murinen Makrophagen sowohl f{\"u}r die B. pseudomallei-induzierte Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 durch das Nlrc4-Inflammasom als auch den nachfolgenden pyroptotischen Zelltod verantwortlich ist. Durch die Attenuierung der BsaK-Mutante im Mausmodell wird gleichzeitig die Bedeutung von Typ-III-Sekretionssystemen f{\"u}r die Virulenz pathogener Bakterien unterstrichen.},
  language  = {de}
}