@phdthesis{Kliewe2014,
  author    = {Felix Kliewe},
  title     = {Interaktion des Repressors Opi1 der Phospholipid-Biosynthese mit Regulatoren des Phosphat-Stoffwechsels und pleiotropen Corepressoren in der Hefe Saccharomyces cerevisiae},
  journal    = {Interaction of repressor Opi1 of phospholipid biosynthesis with regulatory proteins of phosphate metabolism and pleiotropic co-repressors in the yeast Saccharomyces cerevisiae},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001745-8},
  year      = {2014},
  abstract  = {In der Hefe Saccharomyces cerevisiae werden die Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese auf Transkriptionsebene in Abh{\"a}ngigkeit der Verf{\"u}gbarkeit der Phospholipidvorstufen Inositol und Cholin (IC) {\"u}ber ein in der Promotorregion befindliches UAS-Element, genannt ICRE („inositol/choline-responsive element“), reguliert. Bei Mangel an IC kommt es zu einer Anh{\"a}ufung des Intermediats Phosphatids{\"a}ure, wodurch der Repressor Opi1 au{\"s}erhalb des Zellkerns am endoplasmatischen Reticulum verankert wird. Dadurch kann ein Heterodimer, bestehend aus den bHLH-Proteinen Ino2 und Ino4, an das ICRE-Motiv binden und die transkriptionelle Aktivierung vermitteln. Ist ausreichend IC vorhanden, gelangt der Repressor Opi1 in den Zellkern und bindet an Ino2. Dadurch ist eine Aktivierung nicht mehr m{\"o}glich. Ferner kontaktiert Opi1 {\"u}ber seine Opi1-Sin3-Interaktionsdom{\"a}ne (OSID) die Corepressor-Komplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die durch Rekrutierung von Histondeacetylasen (HDACs) zur Chromatinverdichtung und damit zur Genrepression f{\"u}hren. In einer fr{\"u}heren Arbeit wurde beobachtet, dass die regulierte Expression von Genen der Phospholipid-Biosynthese auch durch die Phosphatkonzentration beeinflusst wird. Es konnte festgestellt werden, dass bei Phosphatmangelbedingungen die Expression ICRE-abh{\"a}ngiger Gene auf 10 \% reduziert ist. Eine Δopi1-Mutante zeigte dieses Expressionsmuster jedoch nicht mehr. Dieser Befund wies darauf hin, dass Opi1 seine Repressorfunktion sowohl bei IC-{\"U}berschuss als auch bei Phosphatmangel ausf{\"u}hrt. Ein Protein, welches die Phosphatverf{\"u}gbarkeit an Opi1 m{\"o}glicherweise {\"u}ber eine Phosphorylierung vermitteln k{\"o}nnte, ist die cyclinabh{\"a}ngige Proteinkinase Pho85, f{\"u}r die eine in vitro Interaktion mit Opi1 gezeigt wurde. Um diese Hypothese zu {\"u}berpr{\"u}fen, wurden mittels gerichteter Mutagenese Aminos{\"a}urereste mutma{\"s}licher Pho85-Phosphorylierungsstellen im Opi1-Protein (S321, T51) gegen das nicht mehr phosphorylierbare Alanin ausgetauscht. Hefest{\"a}mme, die solche Opi1-Protein-varianten (S321A, T51A) synthetisierten, zeigten jedoch weiterhin einen klaren Einfluss des Phosphatmangels auf die Expression eines ICRE-regulierten Reportergens. Dies l{\"a}sst darauf schlie{\"s}en, dass die Repression unter Phosphatmangelbedingungen nicht {\"u}ber eine Phosphorylierung von Opi1 durch Pho85 zu Stande kommt. Parallel durchgef{\"u}hrte in vitro-Interaktionsstudien zeigten, dass die Bindung von Pho85 an Opi1 {\"u}ber zwei unabh{\"a}ngig voneinander funktionierende Interaktionsdom{\"a}nen im Opi1-Protein (aa 30-70 und aa 321-350) erfolgt. Mit Hilfe des „Two-Hybrid“-Systems wurde festgestellt, dass die Opi1-Pho85 Wechselwirkung in vivo phosphatabh{\"a}ngig stattfindet. Die Befunde erlauben die Hypothese, dass Pho85 bei Phosphat{\"u}berschuss u. a. die OSID im Opi1 abdeckt, dadurch die Wechsel-wirkung mit Sin3/Cyc8 verhindert und eine gesteigerte Genexpression zul{\"a}sst. Mittels Chromatin-Immunopr{\"a}zipitation (ChIP) konnte gezeigt werden, dass Opi1, Co-Repressoren wie Sin3 und Cyc8 als auch die HDACs Hda1 und Hos1 an Promotoren ICRE-regulierter Gene Ino2-abh{\"a}ngig anwesend sind. Des Weiteren wurde festgestellt, dass sich Sin3 unabh{\"a}ngig von Opi1 an ICRE-haltigen Promotoren befindet. Dieses Ergebnis wider-sprach einer fr{\"u}heren Arbeitshypothese, konnte aber durch weitere Versuche, die eine direkte in vitro Interaktion von Sin3 mit dem Ino2-Aktivator zeigten, plausibel in ein neues Rekrutierungsmodell eingef{\"u}gt werden. Abschlie{\"s}end wurden die am Beispiel von Opi1 gewonnenen Erkenntnisse durch in vitro Interaktionsanalysen diverser spezifischer Repressoren mit den pleiotropen Co-Repressoren Sin3 und Cyc8/Tup1 erweitert. F{\"u}r zahlreiche Repressoren wurde gefunden, dass sie parallel mit Sin3 und Cyc8 interagieren (u. a. Rox1, Yox1, Dal80 und Mot3). Durch Kartierungsexperimente konnten minimale Repressordom{\"a}nen charakterisiert werden, die die Interaktion zu Sin3 bzw. Cyc8 vermitteln, und sequenzhomologe Dom{\"a}nenstrukturen analysiert werden. Des Weiteren zeigte sich, dass alle Repressoren, die mit Sin3 wechselwirken, dessen Dom{\"a}nen PAH1 oder PAH2 („paired amphipathic helix“) kontaktieren.},
  language  = {de}
}