@phdthesis{Strohbach2007,
  author    = {Denise Kathrin Strohbach},
  title     = {Modulation von Ribozymaktivit{\"a}t durch gezielte Kontrolle der Sekund{\"a}rstruktur},
  journal    = {Modulation of ribozyme activity by site-directed alteration of ribozyme structure},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000406-8},
  year      = {2007},
  abstract  = {Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Strukturen, die unter anderem in viralen Satelliten-RNAs entdeckt wurden, wo sie durch reversible Spaltung des Phosphatr{\"u}ckgrates die virale Replikation unterst{\"u}tzen. Durch gezielte strukturelle Manipulation von Ribozymen entstehen wertvolle Werkzeuge, die in vielen bioanalytischen, biotechnologischen und gentherapeutischen Bereichen Anwendung finden. Diese Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit dem funktionalen Design von verschiedenen Ribozymmotiven, deren kinetische und strukturelle Charakterisierung sowie deren potentielle Anwendung. In einem ersten Projekt sollten durch rationales Design RNA-Schalter, sogenannte Riboswitches, entwickelt werden. Die Aktivit{\"a}t dieser schaltbaren Ribozyme h{\"a}ngt von einem externen Kofaktor ab. Solche Konstrukte k{\"o}nnen durch gezielte Kombination einer nat{\"u}rlichen Ribozymdom{\"a}ne mit einer Aptamerdom{\"a}ne, die spezifisch einen Kofaktor (darunter Nukleins{\"a}uren, Peptide, organische Molek{\"u}le und Metallionen) binden kann, gewonnen werden. Durch Bindung dieses Kofaktors wird eine konformelle {\"A}nderung innerhalb der Ribozymstruktur erzwungen die einen Anstieg- oder Abfall der katalytischen Aktivit{\"a}t zur Folge hat. Derartige Systeme besitzen biosensorisches Potential. Betrachtet man den Kofaktor als Analyten, kann das Bindungsereignis, also die Detektion, {\"u}ber ein Spaltereignis beobachtet werden. Die Reversibilit{\"a}t solcher Detektionssysteme konnte bisher nicht demonstriert werden, w{\"u}rde aber deren Attraktivit{\"a}t und Anwendungspotential erh{\"o}hen. In dieser Arbeit wurden Ribozyme auf Basis des Hairpin-Motivs entwickelt, die in Abh{\"a}ngigkeit von Flavinmononukleotid (FMN) aktiv sind. Um die Reversibilit{\"a}t des Prozesses zu gestatten, m{\"u}sste FMN beliebig aus der Aptamerdom{\"a}ne entfernt und in diese wieder eingelagert werden k{\"o}nnen. Dies sollte {\"u}ber die Kontrolle der Molek{\"u}lgeometrie des Kofaktors erfolgen. Durch chemische Reduktion von FMN werden strukturelle und elektronische Ver{\"a}nderungen innerhalb des Molek{\"u}ls hervorgerufen, die die Bindungsaffinit{\"a}t verringern sollten. Versuche mit Reduktionsmitteln konnten die Reversibilit{\"a}t des Schaltvorganges in einem ersten Ansatz demonstrieren. Um ein mehrmaliges, kontrolliertes Schalten zu gestatten, wurde zur gezielten Manipulation des Oxidationszustandes von FMN eine elektrochemische Zelle entwickelt. Dazu musste das klassische Drei-Elektroden-System dem hier vorliegenden System angepasst werden. Zum einen muss die quantitative Reduktion/Oxidation von FMN in einem kleinen Probenvolumen von einigen Mikrolitern gew{\"a}hrleistet werden, zum anderen sollte unter Sauerstoffausschluss gearbeitet werden, um unerw{\"u}nschte Reoxidationsprozesse zu verhindern. Mit der entwickelten Zelle konnte in einem Spaltexperiment ansatzweise die Verringerung der Ribozymaktivit{\"a}t durch elektrochemische Reduktion des Kofaktors demonstriert werden. Schnelles und pr{\"a}zises Schalten des Systems wurde durch Diffusionsprozesse der reagierenden Spezies zur Elektrodenoberfl{\"a}che limitiert und konnte mit dieser Anordnung nicht demonstriert werden. Neben kinetischen Studien sollten strukturelle Untersuchungen die Charakterisierung des RNA-Schalters vervollst{\"a}ndigen. Hierbei wurden die konformellen {\"A}nderungen innerhalb des Ribozyms bei Bindung des Kofaktors ESR-spektroskopisch studiert. Allgemein m{\"u}ssen dazu Nukleins{\"a}uren mit paramagnetischen Spinsonden markiert werden. In diesem Zusammenhang wurden Synthese- und Markierungsmethoden zum Erhalt spinmarkierter Oligonukleotide etabliert. Ein zweites Projekt besch{\"a}ftigte sich mit der Entwicklung von Reparatursystemen auf Basis kleiner katalytischer RNA-Motive. Die in diesem Zusammenhang entwickelten Twinribozyme besitzen gro{\"s}es Potential zur Reparatur von Gendefekten auf RNA-Ebene. Hierbei wird ein kurzer Sequenzabschnitt innerhalb eines RNA-Stranges gegen eine alternative Sequenz durch doppelte Spaltung und Ligation ausgetauscht. Diese Methode sollte es erm{\"o}glichen, mutierte Sequenzbereiche auf mRNA-Ebene gegen die entsprechend korrekte Sequenz zu ersetzen und Gendefekte zu beheben. Twinribozyme entstehen durch Duplikation zweier katalytischer Motive und wurden als erstes unter Verwendung des Hairpinribozymmotivs entwickelt. Da nicht alle Substratsequenzen vom Hairpinribozym toleriert werden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung eines Hammerheadribozyms zur Entwicklung eines Twinribozyms {\"u}berpr{\"u}ft, um die Palette derartiger Werkzeuge zu erweitern. Gezeigt werden konnte, dass der Austausch einer Sequenz zwar katalysiert wird, die geringe Produktausbeute von nur 3\% eine gentherapeutische Anwendung zun{\"a}chst noch in Frage stellt. Hier sollten strukturelle Optimierungen des Systems zu einem besseren Ergebnis f{\"u}hren. Insgesamt konnte demonstriert werden, dass die Aktivit{\"a}t von RNA-Enzymen gezielt durch die Einf{\"u}hrung von charakteristischen Strukturelementen manipuliert und kontrolliert werden kann und somit Systeme mit hohem Anwendungspotential geschaffen wurden.},
  language  = {de}
}