@phdthesis{Doerries2014,
  author    = {Kirsten D{\"o}rries},
  title     = {Metabolic insights into Staphylococcus aureus and its natural habitats},
  journal    = {Charakterisierung des Metaboloms von Staphylococcus aureus und seinen nat{\"u}rlichen Habitaten},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002026-8},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das Forschungsfeld \"Metabolomics\" ist Teil der gesamten -omics Technologien, wie auch Genomics, Transkriptomics und Proteomics, und bearbeitet die Analyse von extra- und intra-zellul{\"a}ren Stoffwechselprodukten eines biologischen Systems. F{\"u}r das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus wurden bisher kaum Metabolomdaten erhoben. Daher ist das Ziel dieser Dissertation eine umfassende Charakterisierung des Exo- und Endometaboloms von S. aureus. Daf{\"u}r wurde die Metabolomics-Messplattform, bestehend aus einem 1H-NMR-Spekrometer, einer HPLC-MS- und einer GC-MS-Anlage, genutzt. F{\"u}r die Metaboliten-Analyse, besonders die der intrazellul{\"a}ren Metabolite, ist ein optimales Probenahme-Protokoll unerl{\"a}sslich, da dieses ein besonders schnelles und effektives Quenchen des Metabolismus des zu untersuchenden Organismus gew{\"a}hrleisten muss. In dieser Arbeit werden die wichtigsten zu beachtenden Punkte w{\"a}hrend der Probenahme und der anschlie{\"s}enden Analyse mit den verschiedenen Instrumenten vorgestellt (Buchkapitel I). Zudem werden kritische Schritte in der Datenanalyse, wie die sichere Identi-fizierung von Signalen und die absolute Quantifizierung von intrazellul{\"a}ren Metaboliten erl{\"a}utert. Mithilfe des optimalen Protokolls wurde eine erste umfassende Metabolom-Analyse entlang einer Wachstumskurve von S. aureus COL unter aeroben Bedingungen in CDM durchgef{\"u}hrt (Artikel I). Diese Analyse schlie{\"s}t sowohl die logarithmisch wachsenden also auch die durch Glukose-Mangel im Wachstum gestoppten S. aureus Zellen ein. Dabei wurde erstmalig die mengenm{\"a}{\"s}ige Verteilung der Metabolite des Prim{\"a}rstoffwechsels beschrieben, sowie ihre dynamischen Ver{\"a}nderungen im zeitlichen Verlauf des Experiments. Die detektierte Aufnahme der im Medium verf{\"u}gbaren Glukose und Aminos{\"a}uren, sowie die Sekretion von Overflow-Metaboliten und Intermediaten des Citratzyklus liefern wichtige Informationen {\"u}ber die metabolische Aktivit{\"a}t von S. aureus. Besonders interessant ist dabei die Konzentrationsabnahme der intrazellul{\"a}ren glykolytischen Intermediate parallel zu der sinkenden extrazellul{\"a}ren Glukose-Konzentration. Im Aminos{\"a}ure-Pool wurden die mengenm{\"a}{\"s}ig st{\"a}rksten Konzentrations{\"a}nderungen in Glukose-hungernden S. aureus Zellen nachgewiesen. W{\"a}hrend einer Infektion im menschlichen K{\"o}rper, ist S. aureus in Abh{\"a}ngigkeit von der Entfernung des infizierten Gewebes zu den Kapillaren unterschiedlichen Sauerstoff-Partialdr{\"u}cken ausgesetzt. F{\"u}r die Untersuchung der Adaptation an fermentative Bedingungen, unter Nutzung des CDM als Kultivierungsmedium, wurden aerob wachsende S. aureus COL Zellen in eine strikt anaerobe Umgebung ohne alternative Elektronenakzeptoren umgesetzt. Ein schnelles Anschalten des Fermentationsstoffwechsels erm{\"o}glichte lineares Wachstum, wobei Glukose mit einer h{\"o}heren Rate aufgenommen wurde als unter aeroben Bedingungen. Obwohl Proteomdaten eine starke Induktion der Proteine f{\"u}r die Laktat- und die gemischte S{\"a}ure-G{\"a}rung zeigen, konnte auf Metabolom-Ebene eine deutlich dominierende Laktat-G{\"a}rung nachgewiesen werden. Aminos{\"a}uren wurden nur begrenzt verwertet. Mit zus{\"a}tzlich eintretender Glukose-Limitation war keine Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels mehr m{\"o}glich, da Arginin als alternative Energiequelle nicht ausreichend genutzt wurde. Um das Wachstumsverhalten und den N{\"a}hrstoff-Verbrauch von S. aureus in einer Umgebung {\"a}hnlich der im Wirt zu untersuchen, wurden die beiden S. aureus St{\"a}mme COL und HG001 in einem eukaryotischen Zellkulturmedium kultiviert (Artikel II). Entlang der aeroben Wachstumskurve wurden die metabolischen Footprints beider St{\"a}mme analysiert, wobei unterschiedliche Aufnahme- und Sekretionsmuster nachgewiesen wurden, die zu einer statistische Separation beider St{\"a}mme f{\"u}hrte. Interessanterweise konnte D-Isoleucin im extrazellul{\"a}ren {\"U}berstand beider St{\"a}mme nachgewiesen werden, welches als seltene D-Aminos{\"a}ure vermutlich regulatorische Funktion besitzt. Da dieses Medium auch f{\"u}r die Vorkultivierung von S. aureus f{\"u}r Infektionsversuche verwendet wird, liefert diese Studie wichtige Informationen {\"u}ber die ablaufenden Stoffwechselvorg{\"a}nge unter diesen Bedingungen. Die zunehmende Verbreitung von multiresistenten S. aureus St{\"a}mmen zwingt zur Suche nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen und auch zu einem verbesserten Verst{\"a}ndnis grund-legender physiologischer Vorg{\"a}nge im Stoffwechsel von S. aureus. Im Zuge dessen wurde die Reaktion von S. aureus HG001 nach Stress mit Antibiotika unterschiedlicher Wirkmechanismen (Ciprofloxacin, Erythromycin, Fosfomycin, Vancomycin, Ampicillin) auf intra- und extrazellul{\"a}rer Metaboliten-Ebene untersucht (Artikel III). Innerhalb von zwei Stunden nach antibiotischem Stress wurden die Verl{\"a}ufe von 176 intrazellul{\"a}ren Metaboliten analysiert, was die bislang umfassendste Metabolom-Studie von S. aureus darstellt. Dabei wurden keine Marker-Metabolite f{\"u}r jeden einzel-nen antibiotischen Stress nachgewiesen, vielmehr f{\"u}hrte jedes Antibiotikum zu weitreichenden Ver{\"a}nderungen im gesamten Endometabolom. Am st{\"a}rksten betroffen war dabei der Pool aus Zellwand-Vorstufen, was das Potential dieses Stoffwechselweges als Zielstruktur f{\"u}r neue effektive Antibiotika best{\"a}tigt. Bei der Besiedlung des menschlichen K{\"o}rpers wird S. aureus vor allem auf der Nasenschleim-haut und auf der Haut von Armen nachgewiesen. Um erste Einblicke in die N{\"a}hrstoffversorgung in diesen nat{\"u}rlichen Habitaten zu erlangen, wurden Metabolom-Analysen von menschlichem Nasen-schleim und Schwei{\"s} durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden Aminos{\"a}uren in geringen Konzentrationen nach-gewiesen, jedoch f{\"u}r Laktat und Harnstoff sehr hohe Konzentrationen detektiert. Bez{\"u}glich der Aminos{\"a}ure-Versorgung {\"a}hnelt das RPMI-Medium damit den Gegebenheiten w{\"a}hrend der Besied-lung des menschlichen K{\"o}rpers. F{\"u}r zuk{\"u}nftige Untersuchungen zur Physiologie von S. aureus kann die Verwendung von einem Kultivierungsmedium mit hohem Laktat- und Harnstoffgehalt wichtige Informationen zur Adaptation des Bakteriums an die Wirtsumgebung liefern. Insgesamt tragen die Ergebnisse der Metabolom-Studien zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der zellul{\"a}ren Vorg{\"a}nge innerhalb des Bakteriums bei. Durch die Analyse von extrazellul{\"a}ren N{\"a}hrstoffen k{\"o}nnen au{\"s}erdem wichtige Faktoren ausfindig gemacht werden, die entscheidenden Einfluss auf den Stoffwechsel und auch auf die Virulenz von S. aureus haben.},
  language  = {en}
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