@phdthesis{Sowa2019, author = {Miriam Anne Sowa}, title = {Transaminase-vermittelte Synthese β-chiraler Amine}, journal = {Transaminase-mediated Synthesis of β-chiral Amines}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-25596}, pages = {100}, year = {2019}, abstract = {β-chirale Amine, wie zum Beispiel Pregabalin und Baclofen, sind Verbindungen von gro{\"s}em Interesse insbesondere f{\"u}r die pharmazeutische Industrie. Biokatalytische Herstellungsverfahren, vor allem Aminierungsreaktionen, sind bisher nur geringf{\"u}gig untersucht worden und werden nach aktuellem Wissenstand bis auf die Synthese von Niraparib noch nicht in gro{\"s}technischem Ma{\"s}stab eingesetzt. W{\"u}nschenswert ist die Etablierung einer Synthese, welche (S)-Pregabalin bzw. (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten liefert, da diese beiden Enantiomere jeweils die h{\"o}here biologische Wirksamkeit aufweisen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Pregabalin und Baclofen als Modellverbindungen f{\"u}r β-chirale Amine mit Hilfe einer selektiven Amintransaminase oder Amindehydrogenase. Zun{\"a}chst wurde erfolgreich mit Hilfe der Gaschromatographie bzw. HPLC jeweils eine chirale Analytik f{\"u}r die beiden Reaktionsprodukte sowie die Baclofen-Derivate etabliert, die stabil reproduzierbar und auch zur Quantifizierung geeignet war. Auch f{\"u}r 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-butters{\"a}ure-t-butylester konnte eine GC-Methode entwickelt werden, die Aufschluss {\"u}ber die Konzentration und den Enantiomeren{\"u}berschuss gab. Die vier zur Verf{\"u}gung gestellten Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und mittels IMAC-Methode gereinigt werden. Trotz geringer Aktivit{\"a}ten in einem photometrischen NADH-Assay konnte jedoch keine Produktbildung nachgewiesen werden. Eine Kollektion von ca. 150 Amintransaminasen wurde bez{\"u}glich der Desaminierung von Pregabalin und Baclofen mittels D{\"u}nnschichtchromatographie untersucht. In Richtung der Aminierung wurde ein photometrischer Acetophenon-Assay verwendet. Dabei wurden f{\"u}r Pregabalin sechs und f{\"u}r Baclofen 17 potenzielle Kandidaten ermittelt. Besonders vielversprechend war die Variante 3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR\_5M), welche 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-butters{\"a}ure-t-butylester als Substrat akzeptierte. Nach der Ermittlung eines geeigneten Aminodonors und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten Ums{\"a}tze bis zu 90\% bei 99\%ee (R) mit IMAC-gereinigter 3FCR\_5M erzielt werden. Um Kosten f{\"u}r ein sp{\"a}teres gro{\"s}technisches Verfahren einzusparen, sollte die Reaktion ebenfalls f{\"u}r den Einsatz von Zellextrakt optimiert werden. Dabei wurde beobachtet, dass geringere Enantiomeren{\"u}bersch{\"u}sse erzielt wurden als mit dem gereinigten Enzym und der Substratverbrauch h{\"o}her als die Produktbildung war. Als m{\"o}gliche Ursachen wurden der Umsatz des Substrats durch ein E. coli eigenes Enzym, beispielsweise eine Aldehydreduktase oder Aldehyddehydrogenase, sowie eine Beeinflussung der Enantioselektivit{\"a}t durch die ver{\"a}nderte chemische Umgebung oder den selektiven Entzug des gew{\"u}nschten Substrat-Enantiomers durch eine selektive Nebenreaktion hypothetisiert. Dieses Ph{\"a}nomen konnte durch eine vorgeschaltete Reinigung mittels fraktionierender Ammoniumsulfat-F{\"a}llung jedoch erfolgreich umgangen werden. Mit dieser Methode konnten vergleichbar hohe Ums{\"a}tze und Enantiomeren{\"u}bersch{\"u}sse wie mit dem IMAC-gereinigten Enzym erreicht werden. Bei ersten Vorversuchen zum Up-Scaling der Reaktion wurde festgestellt, dass eine h{\"o}here Substratkonzentration nicht einen proportional h{\"o}heren Umsatz zur Folge hatte, jedoch konnte der Umsatz durch eine versetzte Zugabe der Enzyml{\"o}sung gesteigert werden, sodass ein Prozess mit diesem Biokatalysator in seiner aktuellen Form eine kontinuierliche Zugabe erfordern w{\"u}rde. Praktikabel w{\"a}re einer Verminderung der Substrat-Inhibierung und Erh{\"o}hung der Enzymstabilit{\"a}t durch weiteres Protein-Engineering. Auch zur Produktion von 3FCR\_5M im gr{\"o}{\"s}eren Ma{\"s}stab wurden Experimente vorgenommen. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine vielversprechende Expression im Bioreaktor bei einer kontinuierlichen Temperatur von 30°C und einer Expressionsdauer von sieben Stunden. Nach einigen Optimierungsschritten konnte im Bioreaktor die zwanzigfache volumetrische Aktivit{\"a}t im Vergleich zur Expression im Sch{\"u}ttelkolben erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit, trotz weiterem Optimierungsbedarf, eine sehr gute Grundlage f{\"u}r die Transaminase-vermittelte Synthese von (R)-Baclofen geschaffen wurde. In zuk{\"u}nftigen Arbeiten sollte die Optimierung der Reaktion in gro{\"s}em Ma{\"s}stab im Fokus stehen.}, language = {de} }