@phdthesis{Heiden2020,
  author    = {Heiden, Sandra},
  title     = {Untersuchung von Virulenzdeterminanten des Newcastle Disease Virus mit Hilfe von Virusrekombinanten},
  institution = {Abteilung f{\"u}r Mikrobiologie und Molekularbiologie},
  pages     = {113},
  year      = {2020},
  abstract  = {Die Newcastle Krankheit (Newcastle Disease, ND) wird durch das avi{\"a}re Paramyxovirus-1 (APMV-1) verursacht und z{\"a}hlt zu den bedeutendsten Viruserkrankungen des Gefl{\"u}gels, wobei die Auspr{\"a}gung der Krankheitssymptome sehr stark variiert. Das APMV-1 der Taube (pigeontype paramyxovirus, PPMV-1) infiziert gr{\"o}ßtenteils Brief-, Rasse-, Stadt- und Wildtauben, jedoch ist auch Wirtschaftsgefl{\"u}gel f{\"u}r diesen Erreger empf{\"a}nglich. Die Krankheit ist weltweit verbreitet und besonders die schweren Verlaufsformen, ausgel{\"o}st durch den mesogenen und den velogenen Pathogenit{\"a}tstyp, f{\"u}hren bis heute zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Durch die Entwicklung des reversen genetischen Systems f{\"u}r das NDV ist es m{\"o}glich, verschiedene Bereiche des viralen Genoms unterschiedlich pathogener NDV-Isolate auszutauschen und rekombinante Viren zu generieren, um m{\"o}gliche Virulenzdeterminanten zu identifizieren. Lange Zeit galt die Aminos{\"a}uresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des Fusionsproteins als die Virulenzdeterminante des NDV. Studien der letzten Jahre belegen aber zunehmend, dass es weitere Sequenzabschnitte im Genom gibt, die Einfluss auf die Pathogenit{\"a}t haben. Besonders bei den Taubenisolaten zeigte sich, dass diese trotz einer polybasischen Aminos{\"a}uresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des F-Proteins, die typisch f{\"u}r meso- und velogene APMV-1 ist, mit einem ermittelten intrazerebralen Pathogenit{\"a}tsindex (ICPI) < 0,7 als lentogen (niedrig virulent) einzuordnen sind. Die Bestimmung der Gesamtsequenz des vorliegenden PPMV-1 Isolates R75/98 und die Herstellung des entsprechenden rekombinanten Virus rR75/98 waren Ziel dieser Arbeit. Nach der in vitro-Charakterisierung, die keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Rekombinante zeigte, verdeutlichte die ICPI-Bestimmung, dass sich R75/98 und rR75/98 in ihrer Pathogenit{\"a}t unterschieden. W{\"a}hrend R75/98 mit einem ICPI von 1,1 als mesogen eingestuft wurde, entsprach das rekombinante Virus rR75/98 mit einem ICPI von 0,28 dem lentogenen Pathotyp. Durch einmalige Passage der Rekombinante im Tier entstand das Reisolat RrR75/98, welches sich in seinen in vitro-Eigenschaften nicht von den beiden anderen Isolaten unterschied, aber in seiner Pathogenit{\"a}t (ICPI 0,93) wieder dem mesogenen Ausgansvirus R75/98 entsprach. Unter Nutzung des Next Generation Sequencing war es m{\"o}glich, die Grundlagen f{\"u}r diese Pathogenit{\"a}tsunterschiede aufzuzeigen. W{\"a}hrend es zwischen R75/98 und rR75/98 insgesamt acht Aminos{\"a}uresubstitutionen gab (drei im F-Protein, zwei im HN-Protein und drei im L-Protein), die zu einer Verminderung der Pathogenit{\"a}t f{\"u}hrten, wurden nur zwei Aminos{\"a}uremodifikationen (jeweils eine im F- und L-Protein) nachgewiesen, um die Pathogenit{\"a}tssteigerung vom lentogenen rR75/98 hin zum mesogenen RrR75/98 hervorzurufen. Beide Aminos{\"a}ureaustausche haben einen Effekt auf die vorhergesagte Proteinstruktur und beeinflussen vermutlich die Proteinfaltung, was wiederum eine nicht unwesentliche Auswirkung auf die biologische Aktivit{\"a}t des Virus haben kann. Besonders die Modifikation im F-Protein an Aminos{\"a}ureposition 472 verdeutlicht, dass neben der Aminos{\"a}uresequenz an der proteolytischen Spaltstelle andere Bereiche dieses Proteins Einfluss auf die NDV-Virulenz haben. Zur Untersuchung des Einflusses einzelner Abschnitte des F-Proteins auf die Pathogenit{\"a}t wurden im urspr{\"u}nglich lentogenen NDV Clone 30 einzelne Sequenzbereiche durch die des mesogenen PPMV-1 R75/98 substituiert, die entsprechenden rekombinanten Viren generiert und charakterisiert. Es zeigte sich, dass sowohl die Expression als auch die Inkorporation der chim{\"a}ren Fusionsproteine mittels Western-Blot nachgewiesen werden konnte. Die Rekombinanten unterschieden sich weder in Gr{\"o}ße noch in Form (Elektronenmikroskopie) und die chim{\"a}ren Fusionsproteine konnten an der Plasmamembran der Wirtszellen detektiert werden. Alle Rekombinanten waren in der Lage, Synzytien auszubilden und in verschiedenen Zelllinien (Wachtelmuskelzelle, H{\"u}hnerembryofibroblasten) bzw. in embryonierten H{\"u}hnereiern zu replizieren. Bei der Bestimmung des ICPIs zeigten sich jedoch Unterschiede. Zwei der sechs Rekombinanten wurden als lentogen eingestuft, die anderen vier wurden dem mesogenen Pathogenit{\"a}tstyp zugeordnet. Es konnte gezeigt werden, dass neben der Interaktion der homologen F1- und F2-Untereinheit, die zytoplasmatische Dom{\"a}ne des Fusionsproteins einen bedeutenden Einfluss auf die Pathogenit{\"a}t von NDV hat. Auch f{\"u}r andere Vertreter der Paramyxoviren ist bekannt, dass die zytoplasmatische Dom{\"a}ne der beiden Oberfl{\"a}chenproteine F und HN mit dem M-Protein interagiert und diese Interaktion wichtig f{\"u}r den Zusammenbau der Viruspartikel, den Knospungsvorgang und die Freisetzung der Viren ist. Neben dem Fusionsprotein existieren zus{\"a}tzlich Virulenzdeterminanten in den weiteren NDV-Proteinen. W{\"a}hrend es bereits Untersuchungen zum Einfluss auf die Pathogenit{\"a}t f{\"u}r die Proteine NP, P, V, M, F, HN und L gibt, war es noch nicht m{\"o}glich, eine Aussage zum W-Protein zu treffen, da der Nachweis dieses Proteins bis dato nicht erfolgte. Zun{\"a}chst wurde f{\"u}r unterschiedlich pathogene NDV der Bereich der P-Gen-Editierungsstelle amplifiziert, gefolgt von einer Tiefensequenzierung, um zus{\"a}tzlich zur P- und V-mRNA auch die W-mRNA nachzuweisen und deren mengenm{\"a}ßigen Anteil zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem Plasmide hergestellt, die f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Arbeiten genutzt werden konnten, in denen erstmals der Nachweis des W-Proteins f{\"u}r NDV gelang.},
  subject      = {Newcastle Disease},
  language  = {de}
}