@phdthesis{R{\"o}nfeldt2020, author = {R{\"o}nfeldt, Sebastian}, title = {Struktur-Funktions-Beziehungen des Pseudorabies Virus pUL31 w{\"a}hrend der Kernfreisetzung neusynthetisierter Nukleokapside}, institution = {Abteilung f{\"u}r Mikrobiologie und Molekularbiologie}, pages = {150}, year = {2020}, abstract = {Der Kernexport neusynthetisierter Kapside stellt einen Schl{\"u}sselprozess in der Herpesvirus-Replikation dar. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Vesikel-vermittelten Translokation sind jedoch noch nicht vollst{\"a}ndig verstanden. Der nuclear egress wird dabei maßgeblich von zwei viralen Proteinen dirigiert, die in PrV und HSV-1/-2 als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden und in allen Herpesviren konserviert sind. Beide Proteine interagieren an der inneren Kernmembran, wo sie den sogenannten nuclear egress complex (NEC) bilden. W{\"a}hrend pUL34 ein membranst{\"a}ndiges Protein in der Kernmembran ist, gelangt das l{\"o}sliche pUL31 {\"u}ber einen aktiven Transport in den Kern. Obwohl der erste Schritt der Freisetzung aus dem Kern, die Vesikelbildung und Abschn{\"u}rung an der inneren Kernmembran, schon gut untersucht ist und auch die Kristallstrukturen des NEC f{\"u}r verschiedene Herpesviren ermittelt werden konnte, sind noch viele Fragen offen. So war zu Beginn dieser Arbeit noch unklar wie die Kapside in diese H{\"u}llen rekrutiert werden und welche Rolle die nicht konservierte und offensichtlich flexible N-terminale Dom{\"a}ne von pUL31, die nicht in den Kristallstrukturen dargestellt werden konnte, f{\"u}r die Regulierung dieses Prozesses spielt. So konzentrierte sich diese Arbeit auf die Fragen, wie die Kapside mit dem NEC interagieren (Paper I und II) und wie der pUL31-N-Terminus diesen ungew{\"o}hnlichen Transportweg beeinflusst (Paper III). Paper I und II: Untersuchungen zur Nukleokapsid/NEC Interaktion Unklar ist, wie der NEC mit seiner Fracht, den Nukleokapsiden, interagiert. Auf Grundlage der vorhandenen Kristallstrukturen des Komplexes unterschiedlicher Herpesviren wurde eine Interaktionsdom{\"a}ne in pUL31 postuliert und angenommen, dass dies mittels elektrostatischer Wechselwirkungen erfolgt. Um dies n{\"a}her zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit geladene Aminos{\"a}uren, die als m{\"o}gliche Interaktionspartner in Frage kommen, zu Alanin mutiert. Die so generierten pUL31 Mutanten wurden, nach Transfektion entsprechender Expressionsplasmide in Kaninchennierenzellen (RK13), auf ihre Lokalisation und nach Koexpression mit pUL34 auf Interaktion getestet. Die Funktionalit{\"a}t der mutierten Proteine w{\"a}hrend der Virusreplikation wurde mit Hilfe stabiler Zelllinien nach Infektion mit PrV-∆UL31 untersucht. {\"U}ber elektronenmikroskopische Analysen wurde der Einfluss auf den Kernexport im Detail betrachtet. Hierbei konnte einem konservierten Lysin an Position 242 in PrV pUL31 im Prozess der Kapsidumh{\"u}llung eine Schl{\"u}sselrolle zugeordnet werden. Dieses Lysin befindet sich im membrandistalen Bereich des NECs, in der Alphahelix H10 von PrV pUL31. Die Substitution des K242 zu Alanin f{\"u}hrte zu einem Abschn{\"u}ren und einer Akkumulation leerer, Virush{\"u}llen-{\"a}hnlicher Vesikel im PNS, obwohl reife Kapside im Kern und in unmittelbarer N{\"a}he zu den Akkumulationen vorhanden waren. Dies f{\"u}hrte zu der Hypothese, dass die Ladung des Lysins direkt an der Interaktion mit dem Kapsid beteiligt ist (Paper I). Obwohl das Lysin 242 in der Struktur des Dimers oberfl{\"a}chenexponiert erschien, zeigten Modellierungen im NEC Oligomer, dass diese Aminos{\"a}ure vermutlich zu tief in der Struktur verborgen ist um als direkter Interaktionspartner in Frage zu kommen. Um die im vorherigen Paper aufgestellte Hypothese zu verifizieren oder auch zu widerlegen, wurde das Lysin nicht nur durch Alanin, sondern auch durch andere nicht geladene, sowohl positiv als auch negativ geladene oder in ihrer Gr{\"o}ße variierende Aminos{\"a}uren substituiert (Paper II). Die neu generierten Substitutionsmutanten wurden nach Transfektion der Expressionsplasmide auf ihre Lokalisation und nach Kotransfektion mit pUL34, auf ihre Interaktion untersucht. Die Funktionalit{\"a}t der mutierten Proteine wurde ebenfalls mit Hilfe stabil exprimierender Zelllinien analysiert. Die vorliegenden Ph{\"a}notypen wurden weiter mittels elektronenmikroskopischer Analysen bestimmt. Es stellte sich heraus, dass unabh{\"a}ngig von der vorhandenen Ladung der Aminos{\"a}ure an Position 242 der Kernexport signifikant beeintr{\"a}chtigt wurde. In Strukturanalysen der einzelnen Mutanten zeigte sich, dass vielmehr die Ausrichtung und Gr{\"o}ße der Seitenkette der ersetzten Aminos{\"a}ure entscheidend war. So st{\"o}rte beispielsweise die Substitution zu Serin und Tyrosin, die die Lage der Seitenketten des urspr{\"u}nglich vorliegenden Lysins imitierten, die Funktion des pUL31 am wenigsten und die Titer erreichten fast Wildtypwerte. Dagegen f{\"u}hrten Substitutionen zu deutlich l{\"a}ngeren Aminos{\"a}uren, wie Glutamins{\"a}ure oder Arginin, zu massiven Beeintr{\"a}chtigungen des nuclear egress. Allerdings f{\"u}hrte keine der Substitutionen zu einem unkontrollierten Abschn{\"u}ren von Vesikeln ohne Aufnahme eines Kapsids an der inneren Kernmembran. Die hier gezeigten Ergebnisse entkr{\"a}fteten die Annahme einer elektrostatischen Interaktion {\"u}ber pUL31 K242 mit den Nukleokapsiden in PrV. Vielmehr deuteten sie auf eine strukturell basierte St{\"o}rung der Kapsidaufnahme in die Vesikel hin (Paper II). Mittels serieller Passagen von Virusmutanten die das UL31 mit der K242A Substitution exprimierten, wurde nach m{\"o}glichen kompensatorischen (second-site) Mutationen gesucht, die den Defekt ausgleichen und dar{\"u}ber hinaus Aufschluss auf die molekularen Ursachen ziehen lassen. Die generierten Virusrekombinanten erreichten bereits nach ca. 10 Passagen Wildtpy-{\"a}hnliche Titer. Aus den Passagen wurden verschiedene Isolate charakterisiert. Es zeigte sich zwar keine Reversion zum Lysin 242, vielmehr waren jedoch entweder weitere Mutationen in pUL31 oder in pUL34 zu finden. W{\"a}hrend die detektierten pUL34 Mutationen zu einem sp{\"a}teren Zeitpunkt charakterisiert werden m{\"u}ssen, wurden die second-site mutierten pUL31 Proteine auf Lokalisation, Kolokalisation und Kompensation des K242A Defektes getestet. Die Ergebnisse best{\"a}rkten die Annahme eines Strukturdefektes durch K242A. Dar{\"u}ber hinaus konnten durch R{\"u}ckmutation des K242A Defektes in den second-site mutierten pUL31 zwei Helices best{\"a}tigt werden (H5 und H11), die {\"a}hnlich der H10 einen starken Einfluss auf den Kernexport besitzen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Aminos{\"a}ure an Position 242 nicht direkt mit den Nukleokapsiden interagiert, dass eingef{\"u}hrte Mutationen jedoch die Umorganisation des NEC-Oligomers, welche offensichtlich notwendig f{\"u}r die effiziente Kapsidumh{\"u}llung an der inneren Kernmembran ist, st{\"o}rt und so den nuclear egress inhibiert (Paper II). Es zeigte sich, dass sich die Struktur-Funktions-Beziehungen in den NECs komplexer darstellen als vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit k{\"o}nnen zwar nicht den Mechanismus des Kapsidexports bzw. der Kapsidbindung und -inkorporation aufkl{\"a}ren doch zeigen sie, dass die Interaktionen der NECs miteinander sehr viel komplexer aber auch wesentlich flexibler sind als zun{\"a}chst angenommen. Paper III: Untersuchung der N-terminalen Dom{\"a}ne von PrV pUL31 Neben einem Kernlokalisationssignal (NLS) beherbergt der N-terminus verschiedener pUL31 Homologer auch zahlreiche vorhergesagte Phosphorylierungsstellen, die an der Regulation des Kernexportes beteiligt sind bzw. sein k{\"o}nnten. Dieser flexible N-terminale Bereich hat in PrV pUL31 eine L{\"a}nge von 25 Aminos{\"a}uren, wobei auffallend viele basische Aminos{\"a}uren in Clustern und verschiedene m{\"o}gliche Phosphorylierungsstellen enthalten sind. Computer-unterst{\"u}tze Analysen (NLStradamus) erkennen in der Aminos{\"a}uresequenz ein bipartites NLS (AS 5-20). Um die Rolle des N-terminalen Bereiches in PrV pUL31 n{\"a}her zu untersuchen, wurde dieser schrittweise verk{\"u}rzt und die basischen Aminos{\"a}uren, sowie die m{\"o}glichen Phosphorylierungsstellen, durch gerichtete Mutagenese durch Alanin ersetzt. Getestet wurden diese Mutanten nach Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in RK13 Zellen auf ihre Lokalisation und, nach Koexpression von pUL34, auf Interaktion und der Umorganisation der Kernmembran. {\"U}ber stabil-exprimierende Zelllinien und nach Infektion mit der UL31 negativen Virusmutante (PrV-∆UL31) wurde die Funktionalit{\"a}t in eplikationsassays und auch ultrastrukturell charakterisiert. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass weder das bipartite NLS noch die vorhergesagten Phosphorylierungsstellen eine entscheidende Rolle spielen. Vielmehr konnte der gr{\"o}ßte Teil des N-Terminus ohne sichtbaren Funktionsverlust deletiert werden, sofern mindestens ein Cluster basischer Aminos{\"a}uren in dieser Region erhalten blieb. Die Ergebnisse zeigten, dass der basische Charakter dieser Region entscheidend f{\"u}r die korrekte Lokalisation, sowie f{\"u}r die Bildung und Funktionalit{\"a}t des NEC ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung im N-Terminus von PrV pUL31, wie auch die roteinkinase pUS3, zwar nicht essenziell f{\"u}r die Freisetzung der Nukleokapside aus dem perinukle{\"a}ren Spalt sind, jedoch diesen Prozess unterst{\"u}tzen (Paper III).}, subject = {Pseudorabies}, language = {de} }