Modulatoren epigenetischer Regulationsmechanismen: Medizinische Chemie neuer KDM4-Inhibitoren und Methodenentwicklung zur SFC-MS-Analytik von Ketaminmetaboliten

  • Die Zusammenhänge zwischen der Aktivität Epigenetik-assoziierter Enzyme und Krankheitsgeschehen neoplastischer Art konnten nicht nur experimentell bestätigt, sondern auch spätestens mit der Zulassung von Inhibitoren der DNA-Methyltransferase und Histon-Desacetylasen kausal bewiesen werden. Die weniger gut untersuchten 2-Oxoglutarat- und Eisen(II)-abhängigen JumonjiC-Domänen enthaltenden Histon-Demethylasen (KDMs) werden aufgrund von Überexpression in einigen Tumorzellen ebenfalls als mögliches epigenetisches Target in der Tumortherapie angesehen. Die in dieser Arbeit synthetisierten KDM4-Inhibitoren basierten zum einen auf Tetrazol- und Hydrazid-haltigen Motiven, für welche synthetische Routen in weitergehenden Untersuchungen entwickelt wurden, um das aliphatische Rückgrat der Moleküle mit aromatischen Resten zu modifizieren oder komplett durch eines auf Basis der Anthranilsäure zu ersetzen. Zum anderen sollten Synthesewege für verschiedenartige (1H-Tetrazol-5 yl)pyridine gefunden werden. Dafür wurde ein Tetrazol in Position vier des Pyridinrings eingefügt, um anschließend systematische Untersuchungen der Seitenkette in Position zwei des Pyridinrings vorzunehmen. Neben direkten Heteroatomverknüpfungen wurden auch Carbonylverbindungen wie Carbonsäureamide oder eine Hydroxamsäure dargestellt. Über zahlreiche Wege konnten ebenfalls Methylengruppen-haltige Verbindungen erfolgreich synthetisiert werden. Die biologische Testung der Verbindungen erfolgte mit einem Antikörper-basierten LANCE-Assay gegen KDM4A. Zusätzlich konnten vier der Substanzen röntgenkristallographisch in der Isoform KDM4D vermessen werden. Eine in Position zwei des Pyridinrings eingefügte Hydroxamsäure zeigte relevante Interaktionen im Enzym und veranschaulichte zugleich, dass (1H-Tetrazol-5 yl)pyridine zu einer hohen Affinität bestimmter Isoformen der Histon-Demethylasen neigen können. Zusätzlich zu den bereits ansatzweise verstandenen Zusammenhängen zwischen Epigenetik und neoplastischen Krankheiten, weisen Experimente im Nagermodell darauf hin, dass epigenetisch modifizierende Enzyme auch an der Entstehung von depressionsartigen Phänotypen beteiligt sind. Die grundsätzliche Erforschung neuer Therapieoptionen abseits der Monoaminhypothese für die Indikation Depression ist jedoch auch deshalb notwendig, weil zugelassene medikamentöse Behandlungsoptionen zum Teil zu starken Nebenwirkungen führen und bis zur Entfaltung der vollen Wirkung oftmals mehrere Wochen vergehen können. Mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten Ketamin behandelte depressive Patienten zeigten häufig eine rasche Symptomlinderung bei vergleichsweise günstigem Nebenwirkungsprofil. Welche Moleküle für diese Effekte ursächlich sind, ist noch Gegenstand aktueller Forschung, da neben Ketamin selber auch Metaboliten wie 2R,6R-Hydroxynorketamin mit antidepressiven Wirkungen assoziiert werden. Für die qualitativen und quantitativen Analyse von R- und S-Ketamin sowie den Metaboliten R- und S-Norketamin, R- und S-Dehydronorketamin und 2R,6R- und 2S,6S Hydroxynorketamin in menschlichem Urin wurde in der vorliegenden Arbeit eine chromatographische Methode entwickelt und validiert, welche die Techniken der überkritischen Fluidchromatographie und Massenspektrometrie nutzt (SFC-MS). Die für die SFC charakteristischen Eigenschaften wie hohe Flussraten und Trenneffizienz sowie die Nutzung von Kohlenstoffdioxid als mobile Phase konnten ausgenutzt werden, um das Trennproblem in nur einer Methode mit kurzer Laufzeit zu lösen. Gleichzeitig wurde der Verbrauch von organischen Lösungsmitteln reduziert. Damit kann die erarbeitete Methode einen nachhaltigen Beitrag für zukünftige Ketaminforschung leisten.
  • The relationship between the activity of different epigenetic-associated enzymes and neoplastic diseases can be regarded as experimentally confirmed. In addition, it was also proven causally with approval of inhibitors of DNA methyltransferase and histone deacetylases. The less well studied 2 oxoglutarate and iron(II)-dependent JumonjiC domain-containing histone demethylases (KDMs) are also considered as a possible epigenetic target in tumor therapy due to overexpression in some tumor cells. One aim of this work was the synthesis of KDM4 inhibitors with tetrazole- and hydrazide motifs. In further investigations of a known inhibitor, synthetic routes were developed to modify the aliphatic backbone with aromatic residues or to completely replace the backbone with an aromatic structure based on anthranilic acid. Moreover, synthetic routes for various (1H-tetrazol-5-yl) pyridines were evaluated. For this purpose, a tetrazole moiety was inserted in position four of the pyridine ring and systematic investigations of the side chain in position two of the pyridine ring were carried out. Besides direct heteroatom coupling, carbonyl compounds such as carboxylic acid amides or a hydroxamic acid were also prepared. Additionally, methylene group containing substances in position two of the pyridine ring were successfully synthesized. Biological testing of the compounds was performed with an antibody-based LANCE assay with KDM4A. In addition, four of the substances were measured by X-ray crystallography bound to the isoform KDM4D. A hydroxamic acid inserted in position two of the pyridine ring showed relevant interactions in the enzyme and demonstrated that (1H-tetrazol-5-yl) pyridines are able to exert high affinity towards certain isoforms of histone demethylases. The relatively well decoded relationships between epigenetics and neoplastic diseases were extended with experiments in rodents which demonstrated that epigenetically modifying enzymes are also involved in the development of depression-like phenotypes. However, the research for new therapeutic options apart from the monoamine hypothesis for depressed patients is of major interest because approved drugs are known to have strong side effects and delayed onset. In the clinic, depressed patients who were treated with the NMDA receptor antagonist ketamine showed rapid symptom relief with a comparably favorable side-effect profile. The responsible molecules for this mood improvement are still the subject of current research, because in addition to ketamine itself some metabolites such as (2R,6R)-hydroxynorketamine are associated with antidepressant effects. For the qualitative and quantitative analysis of (R)- and (S)-ketamine as well as the metabolites (R)- and (S)-norketamine, (R)- and (S)-dehydronorketamine and (2R,6R)- and (2S,6S)-hydroxynorketamine, respectively, in human urine a chromatographic method was developed and validated. Therefore, supercritical fluid chromatography and mass spectrometry were applied (SFC-MS). The inherent features of SFC such as high flow rates, excellent separation efficiency and the utilization of carbon dioxide as an eco-friendly mobile phase component could be used to solve the separation problem in just one time-saving method. In addition, the consumption of organic solvents was reduced. Thus, the developed method may have an impact on future ketamine research.

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Metadaten
Author: Georg Michael Fassauer
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-23691
Title Additional (English):Modulators of Epigenetic Regulations: Medicinal Chemistry of new KDM4-Inhibitors and SFC-MS Method Development for the Analysis of Ketamine Metabolites
Referee:Prof. Dr. Andreas Link, Prof. Dr. Gerhard Scriba
Advisor:Prof. Dr. Andreas Link
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/10/24
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2018/10/19
Release Date:2018/10/24
GND Keyword:Epigenetik, Histon-Demethylase, Ketamin, Quantifizierung, SFC-MS, Tetrazol, Validierung
Pagenumber:239
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften