Zell- und molekularbiologische Studien zur zellautonomen anti-chlamydialen Abwehr dendritischer Zellen und natürlicher Killerzellen

  • Dendritische Zellen (DCs) und die von ihnen geprimten T-Zellen besitzen eine zentrale Funktion in der anti-chlamydialen Immunantwort. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe gelang unter Verwendung von immortalisierten murinen DCs (JAWSII-Zellen) und dem Chlamydienstamm C. psittaci (DC15) die erstmalige Identifizierung eines zellautonomen Abwehrweges in infizierten DCs. Diese zelluläre Selbstverteidigung ist dadurch charakterisiert, dass Chlamydien aus strukturell desintegrierten Inklusionen dem Autophagieweg zugeführt werden und es zur Generierung von Antigenen kommt, die mithilfe von MHCI-Molekülen auf der Zelloberfläche von DCs entsprechenden CD8+ T-Zellen präsentiert werden. Die exakten zellulären Prozesse und biochemischen Abläufe der Desintegration und Autophagie chlamydialer Inklusionen in DCs wurden bisher noch nicht eingehend untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, unter Einsatz des zuvor etablierten murinen Infektionssystems sowie C. psittaci (DC15), den xenophagosomalen Mechanismus der Chlamydienbekämpfung infizierter DCs aufzuklären und weitere, hieran gekoppelte Folgeprozesse und funktionale Interaktionen mit anderen Immunzellen zu charakterisieren. Die hier in Kombination mit zellbiologischen und biochemischen Assays durchgeführten siRNA-Studien belegen eine funktionale Schlüsselrolle der Phospholipase cPLA2 in der anti-chlamydialen Abwehr infizierter DCs. Des Weiteren sprechen die Resultate dafür, dass es durch die Wirkung der von ihr synthetisierten Arachidonsäure zu einer defekten OXPHOS und verminderten ATP-Produktion der Mitochondrien kommt und dies destruktive Auswirkungen auf die energieparasitären Chlamydien hat. Der Verlust der mitochondrialen Funktion sowie der damit verbundene Vitalitätsverlust der Chlamydien scheinen unmittelbar durch den TNF-α/cPLA2-Signalweg kontrolliert zu werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse der Arbeit folgern, dass die Chlamydieninfektion mit einer metabolischen Umprogrammierung von der OXPHOS zur aeroben Glykolyse in DCs einhergeht. Durch die erhöhte Glykolyserate scheinen die infizierten DCs, den durch die geschädigten Mitochondrien entstehenden Energieverlust, kompensieren zu können. Die Assoziation der Inklusionen mit stabilen, acetylierten Mikrotubuli spielt eine entscheidende Rolle sowohl für die erfolgreiche Etablierung der Chlamydien als auch deren vesikuläre Versorgung. Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigen in infizierten DCs eine HDAC6-vermittelte Deacetylierung von Mikrotubuli. Dies führt zu einem Verlust des peri-nukleären Transports bakterieller Vakuolen zum Golgi-Apparat und einer weiteren strukturellen Desintegration der chlamydialen Kompartimente. Der Vorgang ermöglicht es infizierten DCs, die durch cPLA2/Arachidonsäure beeinträchtigen Inklusionen von der vesikulären Versorgung abzukoppeln und durch weitere intrazelluläre Mechanismen zu eliminieren. Die durchgeführten Untersuchungen zum intrazellulären Abbaumechanismus weisen auf eine Aggresomen-vermittelte Xenophagie der bakteriellen Strukturen hin. Massenspektrometrische Analysen der Aggresomen aus DCs sowie die gefundene Beteiligung der mitophagosomalen Schlüsselkomponenten HDAC6, Parkin, Pink-1 sowie p62 und Ubiquitin belegen einen simultanen auto-/xenophagosomalen Abbau defekter Mitochondrien und desintegrierter Chlamydien. Eine vergleichbare intrazelluläre anti-chlamydiale Abwehr konnte ebenfalls in primären Maus- aber auch humanen DCs bestätigt werden. Während des Infektionsverlaufs in DCs kommt es parallel zur Auto-/Xenophagie zu einer vermehrten Bildung von Multivesikularkörperchen (MVBs) und einer daran gekoppelten Formation exosomaler Membranvesikel (iDexosomen), die massiv zur Induktion der IFN-γ-Sekretion benachbarter NK-Zellen und so zur Aktivierung einer NK-Zellantwort während der Chlamydieninfektion beitragen. Weitere Untersuchungen zeigen, dass das TNF-α infizierter DCs in Kombination mit dem durch iDexosomen induzierten IFN-γ von NK-Zellen zu einer erhöhten Apoptoseinduktion nicht-infizierter aber auch Chlamydien-infizierter Epithelzellen führt. Dies deutet darauf hin, dass die chlamydiale Subversion der Apoptose infizierter Zellen zu einem gewissen Teil durch eine kombinatorische Wirkung von Exosomen, IFN-γ und TNF-α „ausgehebelt“ werden kann. Abschließend wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und in welchem Maße die mit DCs kooperierenden NK-Zellen zelluläre Mechanismen besitzen, die eine zelluläre Chlamydieninfektion direkt bekämpfen. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass es bei infizierten NK-Zellen zu keinem Zeitpunkt zu einer erfolgreichen chlamydialen Etablierung und zu keiner zyklusvermittelten EB-RB-Differenzierung kommt. Interessanterweise zeigen die infizierten NK-Zellen eine funktionale Reifung, die durch eine erhöhte IFN-γ-Sekretion, CD146-Induktion, PKC-θ-Aktivierung und Granula-Ausschüttung charakterisiert ist und mit einer Freisetzung von nicht-infektiösen EBs einhergeht. Diese Ausschleusung von Chlamydien konnte hier sowohl für immortalisierte als auch primäre NK-Zellen der Maus gezeigt werden und lässt sich durch die pharmakologische Blockierung zellulärer Exozytoseprozesse inhibieren. Chlamydiale Strukturen innerhalb der NK-Zellen weisen in der Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie eine ausgeprägte Co-Lokalisierung mit sekretorischen Granula auf. Es scheint, dass das Granula-lokalisierte und ausgeschüttete Granzym B verantwortlich für den beobachteten Infektionsverlust, der durch NK-Zellen freigesetzten EBs, ist. Die chlamydiale Infektion und Ausschleusung von EBs hat keinen detektierbaren negativen Einfluss auf die Funktion der NK-Zellen. Sie können nach einer Erstinfektion den chlamydialen Infektions- und Ausschüttungsvorgang in einer weiteren Reaktion reproduzieren und besitzen eine zytotoxische Aktivität, die denen nicht-infizierter NK-Zellen entspricht oder sogar leicht erhöht ist. Die von NK-Zellen freigesetzten nicht-infektiösen Chlamydien zeigen eine nachweisbare Immunogenität, die laut IgG-Subklassen-Charakterisierung immunisierter Mäuse zu einer IgG2c-/IgG2b-dominierten Th1-Antwort führt. Die während der Immunisierung generierten anti-chlamydialen Antikörper besitzen zudem die Fähigkeit zur Infektionsneutralisierung bei der Verwendung epithelialer Wirtszellen als Modelsystem. Im Résumé geben die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue und vertiefende Einblicke in die zellulären und molekularen Abwehrmechanismen Chlamydien-infizierter DCs und NK-Zellen sowie in deren funktionale wechselseitige Kooperation während der anti-chlamydialen Immunreaktion durch iDexosomen, TNF-α und IFN-γ.
  • Dendritic cells (DCs) and their primed T cells play a central role in the anti-chlamydial immune response. Previous studies from our group using immortalized murine DCs (JAWSII cells) and the chlamydia strain C. psittaci (DC15) enabled the first identification of a cell-autonomous defense pathway in infected DCs. This cellular self-defense is characterized by the delivery of chlamydia from structurally disintegrated inclusions to autophagosomal compartments and the generation of antigens presented by MHCI molecules on the cell surface of DCs for the priming and activation of corresponding CD8+ T cells. The exact cellular and biochemical processes responsible for chlamydial disintegration and degradation in DCs have not been studied in detail. Therefore, the aim of this work was to unravel the xenophagosomal mechanism of chlamydial elimination by using the previously established murine DC/C. psittaci (DC15) infection system and to further characterize downstream processes as well as functional interactions with other immune cells. siRNA studies performed in combination with cell biological and biochemical assays demonstrate a key role of phospholipase cPLA2 in the anti-chlamydial defense of infected DCs. Furthermore, the obtained results suggest that cPLA2-synthesized arachidonic acid induces impaired OXPHOS with reduced mitochondrial ATP production, which has destructive effects on the energy-parasitic chlamydia. The loss of mitochondrial function and in turn chlamydial viability appear to be controlled directly by the TNF-α/cPLA2 signaling pathway. Furthermore, the results of this work indicate that chlamydial infection of DCs is associated with metabolic reprogramming from OXPHOS to aerobic glycolysis. Due to the increased glycolysis, infected DCs seem to be able to compensate for the loss of energy caused by damaged mitochondria. The association of chlamydial inclusions with stable, acetylated microtubules plays a critical role in the successful intracellular establishment of chlamydia and its vesicular supply. Investigations of this work revealed that in infected DCs deacetylation of microtubules occurs via HDAC6. This results in a loss of the peri-nuclear transport of bacterial vacuoles to the Golgi apparatus and to instability of chlamydial compartments. The strategy allows infected DCs to decouple inclusions, which are affected by cPLA2/arachidonic acid, from vesicular transport and to eliminate them via further degradation. Experiments on this proposed mechanism indicate an aggresome-mediated xenophagy of the bacterial remnants. Mass spectrometric analysis of DC-derived aggresomes and the involvement of key mitophagosomal factors (HDAC6, Parkin, Pink-1, p62 and ubiquitin) suggest a simultaneous auto-/xenophagosomal degradation of defective mitochondria together with disintegrated chlamydia. Most importantly, a comparable intracellular anti-chlamydial defense was also found in primary mouse DCs and in human DCs. During the course of DC infection, auto-/xenophagy is accompanied by increased formation of multivesicular bodies (MVBs) and exosomal membrane vesicles (iDexosomes), which strongly induce IFN-γ secretion of adjacent NK cells and thus activate an NK cell response during chlamydial infection. Further studies demonstrate that TNF-α of infected DCs in combination with iDexosome-induced IFN-γ of NK cells result in an increased apoptosis of uninfected but also chlamydia-infected epithelial cells. This suggests that chlamydial subversion of apoptosis in infected cells can be undermined to some extent by the combinatorial influence of exosomes, IFN-γ, and TNF-α. The final experiments on this topic analyzed whether and to what extent DC-cooperating NK cells use cellular mechanisms that directly combat chlamydial infections. These studies revealed that neither chlamydial establishment nor cycle-mediated EB-RB differentiation occurred in infected NK cells. Most interestingly, infected NK cells displayed a functional maturation characterized by enhanced IFN-γ secretion, CD146-induction, PKC-θ activation, granule secretion, and the release of non-infectious EBs. Chlamydial release was seen for both immortalized and primary mouse NK cells and could be blocked by pharmacological inhibition of cellular exocytosis. Chlamydial structures within infected NK cells show pronounced colocalization with secretory granules in immunofluorescence as well as electron microscopy. The granule-localized and secreted granzyme B seems to be responsible for the observed loss of EB infectivity in NK cells. Chlamydial infection and EB release have no detectable impact on the function of NK cells. After initial infection, NK cells recover and are able to repeat the cellular defense scenario of chlamydial infection and release. Moreover, they retain their cytotoxic activity, which is comparable to non-infected NK cells or even slightly higher. The non-infectious chlamydia released by NK cells show detectable immunogenicity, which, according to IgG subclass characterization of immunized mice, results in an IgG2c-/IgG2b-dominated Th1 response. Moreover, anti-chlamydial antibodies generated during immunization have the ability to neutralize infection when using epithelial host cells as a model system. In conclusion, the results of this work provide new detailed insights into the cellular and molecular defense mechanisms of chlamydia-infected DCs and NK cells as well as their functional cooperation during the anti-chlamydial immune response via iDexosomes, TNF-α, and IFN-γ.

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Metadaten
Author: Nadine Radomski
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-23716
Title Additional (English):Cell- and molecular biological studies on cell-autonomous anti-chlamydial defense of dendritic cells and natural killer cells
Referee:Dr. Michael Knittler, Prof. Dr. Jürgen Rödel
Advisor:Dr. Michael Knittler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/10/29
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2018/10/16
Release Date:2018/10/29
Tag:zellautonome Immunität
GND Keyword:Immunologie
Pagenumber:218
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie