Exploring the diversity of Nivicolous Myxomycetes: An analysis of the genetic diversity, species distribution and community composition

  • Myxomycetes are protists belonging to the super-group Amoebozoa. The traditional taxonomic system, which is now largely outdated by molecular studies, recognizes five orders: Liceales, Trichiales, Physarales, Stemonitales and Echinosteliales. Molecular phylogenies revealed two basal clades: Physarales and Stemonitales (the so-called dark-spored myxomycetes) are the first; the other above-mentioned orders form the second (the bright-spored myxomycetes). However, except for Echinosteliales none of the traditional orders appears to be monophyletic in the traditionally used delimitation. The dark-spored myxomycetes encompass the majority of the described morphospecies. Due to the high genetic divergence in DNA sequences between the bright- and dark-spored myxomycetes, only the latter are considered in this dissertation. Historically myxomycetes have been described as fungi, due to their macroscopically visible fructifications which, though considerably smaller, resemble those of fungi. These fruit bodies provide enough morphological traits to support a morphological species concept with currently ca. 1000 species described. Therefore diversity studies of myxomycetes have been conducted for over 200 years and a substantial body of data on ecology and distribution of these fructifications exist. From these studies myxomycetes are known to form often distinct communities across terrestrial ecosystems with highly specific habitat requirements, such as snowbanks (nivicolous), herbivore dung (coprophilous) or decaying wood (xylophilous). However knowledge on the myxamoebae – the trophic life stage of the myxomycetes – is very scarce. Only recent advances in molecular techniques such as direct species identification based on DNA sequences from environmental samples (ePCR), have made studies of myxamoebae (and other microbes) possible. From these first molecular based studies myxomycetes are currently estimated to account for between 5 to almost 50% of all soil amoebae, and have been shown to be present in a wide variety of soils. To fully take advantage of these new methods, a molecular DNA marker needs to be established as well as a reference sequence database. The usability of a DNA marker gene depends on its ability to separate species by a distinction between intra- and interspecific divergence between sequences of the same and related species, the so-called ‘barcoding gap’. The first part of this thesis (article I and II) deals with the subject of establishing such a DNA marker and database, and in doing so touches upon the subject of ‘what is a myxomycetes species?’ A total of 1 200 specimens were compiled into a reference database (the largest database to date of dark-spored myxomycetes). The genetic distance from sequence-to-sequence was used to assess genetic clade structures within morphospecies and putative biospecies (sexually isolated linages) were identified. The result was an estimate of hidden diversity, exceeding that of described morphospecies by 99%. The optimum sequence similarity threshold for OTU-picking (genetic species differentiation, denoted Operational Taxonomic Unit) with the used SSU marker was identified as 99.1% similarity. The second part of this thesis (article III and IV) presents ecological studies conducted with NGS (ePCR) in which the established threshold and database are applied and are demonstrated to provide reliable and novel insights into the soil myxamoebae community. It is investigated whether the occurrence of fruit bodies reflects the distribution of soil myxamoebae, and the research questions ‘do myxomycetes show broader realized niches as soil amoebae than as fructifications?’ and ‘are myxamoebae distributions correlated to potential prey organisms (fungi and bacteria)?’ are investigated. In the ecological study presented in article III parallel metabarcoding of bacteria, fungi and dark-spored myxomycete was used for the first time in a joint approach to analyze the communities from an elevational transect in the northern limestone German Alps (48 soil samples). Illumina sequencing of the soil samples revealed 1.68 Mio sequences of a section of the rRNA gene, which were assigned to 578 operational taxonomic units (OTU) from myxomycetes. These show a high similarity (>98%) to 42 different morphospecies (the respective figures for bacteria and fungi were 2.16/5710/215 and 3.68/6133/260, respectively). Multivariate analyses were carried out to disentangle microbial interplay and to identify the main environmental parameters determining the distribution of myxamoebae and thus setting the boundaries for their ecological niches. Potential interactions between the three target organisms were analysed by integrating community composition and phylogenetic diversity with environmental parameters. We identified niche differentiation for all three communities (bacteria, fungi and myxamoebae) which was strongly driven by the vegetation. Bacteria and fungi displayed similar community responses, driven by symbiont species and plant substrate quality. Myxamoebae showed a more patchy distribution, though still clearly stratified among genera, which seemed to be a response to both structural properties of the habitat and specific bacterial taxa. In addition we find an altitudinal species turn-over for all three communities, most likely explained by adaptation to harsh environmental conditions. Finally a high number of myxomycetes OTUs (associated with the genus Lamproderma) not currently represented in our reference database were found, representing potentially novel species. This study is the first to report niche differentiation between the guild of nivicolous (“snowbank”) myxomycetes and thus fine-scale niche differentiation among a predatory soil protist; identifying both potential food preferences and antagonistic interactions with specific bacterial taxa. Finally, the second ecological study (article IV) focuses on comparing the distribution of myxamoebae revealed by ePCR of soil samples with fructifications collected from the same area (714 specimens determined to 30 morphospecies, which form 70 unique ribotypes that can be assigned to 45 ribotype clusters using a 99.1% similarity threshold). The study found a strong coherency between the two inventories, though with species specific relative differences in abundance, which can in part be attributed to the visibility of the fructifications. In addition, a year to year comparison of fructification records gives support to the hypothesis that the abundance of fructifications depends strongly on the onset of snowfall in the previous autumn and the soil temperature regime throughout the winter.
  • Myxomyceten sind Protisten, die der Großgruppe der Amöben (Amoebozoa) zugerechnet werden. Nach dem traditionellen, inzwischen durch molekulare Phylogenien überholten, System werden sie in fünf Ordnungen gegliedert: Liceales, Trichiales, Physarales, Stemonitales und Echinosteliales. Molekulare Phylogenien zeigen jedoch zwei basale Gruppen: Physarales und Stemonitales (die sogenannten dunkelsportigen Myxomyceten) als eine und die anderen genannten Ordnungen (die hellsporigen Myxomyceten) als zweite. Außer den Echinosteliales ist jedoch keine der Ordnungen monophyletisch; sie müssen neu gefasst werden. Die dunkelsporigen Myxomyceten umfassen die Mehrzahl der beschriebenen Morphospezies. Aufgrund der hohen genetischen Divergenz in DNA-Sequenzen zwischen den hell- und dunkelsportigen Myxomyceten werden in dieser Dissertation nur die letzteren berücksichtigt. Aufgrund ihrer kleinen, aber makroskopisch sichtbaren Fruktifikationen wurden die ersten Vertreter jedoch als Pilze beschrieben. Diese Fruchtkörper weisen genug Merkmale auf, um ein morphologisches Artkonzept anzuwenden, nach dem derzeit etwa 1000 Arten beschrieben sind. Basierend auf den im Gelände sichtbaren Fruktifikationen, die herbarisiert werden können, werden bereits seit 200 Jahren Studien zur Diversität von Myxomyceten duchgeführt; daher existieren umfangreiche Daten zur Ökologie und Verbreitung ihrer Fruchtkörper. Aus diesen Arbeiten ist bekannt, dass Myxomyceten charakteristische Gemeinschaften in verschiedensten terrestrischen Ökosystemen bilden und oft hoch spezifische Habitatansprüche stellen. So fruktifizieren manche Arten am Rande des schmelzenden Schnees im Gebirge (nivicole Myxomyceten), andere bevorzugen Dung von Pflanzenfressern (koprophil); eine weitere große Artengemeinschaft bevorzugt sich zersetzendes Holz (xylophil). Im Gegensatz zur Ökologie der Fruktifikationen ist relativ wenig über die Myxamöben bekannt, die den trophischen Lebensabschnitt von Myxomyceten darstellen. Neue molekulare Methoden, wie die direkte Identifikation von Arten mittels DNS-Sequenzen aus Umweltproben (ePCR), ermöglichen heute die Untersuchung von Myxamöben (und anderer Mikroorganismen). Aus ersten molekularbiologischen Studien geht hervor, dass Myxomyceten in vielen verschiedenen Bodenarten vorhanden sind und zwischen 5-50% der im Boden vorkommenden Amöben ausmachen. Um diese neuen Methoden adäquat nutzen zu können ist es nötig, molekulare DNS Marker zu etablieren und Referenzdatenbanken mit den entsprechenden Sequenzen aus akkurat bestimmten Fruktifikationen anzulegen. Damit ein Markergen zur Identifikation von Arten genutzt werden kann, muss dieses möglichst große Unterschiede zwischen Arten aufweisen und gleichzeitig möglichst uniform innerhalb einer Art sein („barcoding gap“). Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit (Artikel I und II) wird die Etablierung eines solchen DNS-Markers mit der dazugehörenden Datenbank beschrieben. Dabei wird auch auf die Anwendbarkeit verschiedener Artkonzepte auf Myxomyceten eingegangen. Hierfür wurden insgesamt 1200 Aufsammlungen von Fruchtkörpern sequenziert und zu einer Datenbank zusammengestellt (zum jetzigen Zeitpunkt die größte Datenbank für eine der beiden großen Gruppen innerhalb dieser Organismen, die dunkelsporigen Myxomyceten). Genetische Distanzen zwischen zwei Sequenzen wurden genutzt, um die genetische Struktur innerhalb einer Morphospezies zu ermitteln und damit eventuell vorhandene kryptische Arten zu identifizieren. Die so geschätzte verborgene Diversität überstieg die Diversität der Morphospezies um 99%. Der optimale Grenzwert der Ähnlichkeit zweier Sequenzen zur Unterscheidung von Arten mit Hilfe von SSU-Markern betrug 99,1%. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit (Artikel III und IV) wird der etablierte Grenzwert sowie die erstellte Datenbank genutzt, um Daten zu Gemeinschaften von Myxamöben in Böden zu generieren. Es wird untersucht, ob man vom Vorkommen der Fruchtkörpern auf die Verbreitung von Myxamöben schließen kann. In diesem Zusammenhang wird diskutiert, ob Myxomyceten als Amöben eine größere realisierte Nische aufweisen als in Form ihrer Fruchtkörper und ob die Verbreitung von Myxamöben in Verbindung zum Vorkommen potentieller Beuteorganismen (Pilze und Bakterien) steht. Paralleles Metabarcoding von Bakterien, Pilzen und dunkelsporigen Myxomyceten in alpinen Böden wird in Artikel III vorgestellt; hier wurden die mikrobiellen Gemeinschaften entlang eines Höhentransekts in den nördlichen Kalkalpen analysiert (48 Proben). Mittels Illumina-Sequenzierung wurden aus den Bodenproben 1.68 Millionen Sequenzen aus einem Abschnitt des rRNA Genes gelesen, die für die Myxomyceten 578 Ribotypen (operational taxonomic units – OTU) zugeordnet wurden. Diese weisen eine hohe Ähnlichkeit (>98%) zu Ribotypen aus 42 morphologisch bestimmten Arten auf (die entsprechenden Zahlen für Bakterien und Pilze betrugen 2.16/5710/215 bzw. 3.67/6133/260). Mit multivariate Analysen wird das Vorkommen verschiedener Mikroben in Beziehung zu Umweltparametern gesetzt, um diskriminierende Faktoren für das Vorkommen von Myxamöben und die Grenzen ihrer ökologischen Nischen zu bestimmen. Potentielle Interaktionen zwischen den drei Organismengemeinschaften wurden identifiziert und analysiert, indem die Zusammensetzung der Gemeinschaften mit phylogenetischen Eigenschaften sowie mit Umweltparametern in Verbindung gebracht wurden. Für alle drei Gemeinschaften wurde die Zusammensetzung hauptsächlich durch die Vegetation bestimmt. Bakterien- und Pilzegemeinschaften zeigten diesbezüglich ähnliche Reaktionen, bedingt durch das Vorkommen von potentiell symbiontischenr Pflanzen (Mykorrhizapartner) bzw. Substrate (sich zersetzendes Pflanzenmaterial). Im Unterschied zu Bakterien und Pilzen zeigen Myxamöben eine lückenhaftere, deutlich lokalere Verbreitung und deutliche Unterschiede innerhalb einzelner Gattungen. Dies scheint in Zusammenhang zur Habitatstruktur und den vorkommenden Bakterienarten zu stehen. Die Artenzusammensetzung aller drei Gruppen änderte sich entlang der Höhentransekte, vermutlich in Anpassungen an die mit der Höhe zunehmend härteren Umweltbedingungen. Zusätzlich wurde eine Vielzahl von Sequenzen (Operational Taxonomic Units – OTUs) für Myxomyceten gefunden, die denen der Gattung Lamproderma ähnelten, aber keiner von Fruktifikationen beschriebenen Art zugeordnet werden konnten. Dies ist die erste Studie, in der die ökologischen Nischen nivicoler Myxomyceten und damit die kleinräumige Nischendifferenzierung eines räuberischen Bodenprotisten beschrieben wurde. Zusätzlich wurde verucht, potentielle Beuteorganismen, aber auch potentiell antagonistische Interaktionen, zu identifizieren. Artikel IV vergleicht abschließend die Verbreitung von Myxamöben im Boden (entsprechend der mit ePCR ermittelten Sequenzen) mit den gesammelten Fruchtkörpern im selben Gebiet (714 bestimmte Aufsammlungen von 30 Morphospezies, die zu 70 Ribotypen gehören, welche wiederum 45 Ribotypgruppen bilden, wenn ein Schwellenwert von 99.1% zugrunde gelegt wird). Die Studie zeigt einen deutlichen Zusammenhang der beiden Inventurmethoden. Die relativen Häufigkeiten der einzelnen Arten (als Fruchtkörper bzw. als Zahl der in Bodenproben ermittelten Sequenzen) unterscheiden sich jedoch stark, was zumindest teilweise auf die verschieden gute Sichtbarkeit der Fruchtkörper verschiedener Arten zurückzuführen ist. Zusätzlich konnte durch den Vergleich mehrerer Jahre die Hypothese bestätigt werden, dass die Anzahl der Fruchtkörper stark vom Einsetzen des Schneefalls im Herbst des Vorjahres und der Bodentemperatur während des Winters abhängt.

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Author: Mathilde Borg Dahl
Title Additional (German):Entdeckung der Vielfalt von Nivicolous Myxomycetes
Referee:Ass. Prof. Regin Rønn, Prof. Carsten Suhr Jacobsen
Advisor:Prof. Martin Schnittler
Document Type:Doctoral Thesis
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/11/28
Granting Institution:Universität Greifswald, Philosophische Fakultät
Date of final exam:2018/10/01
Release Date:2018/11/28
GND Keyword:myxomycetes
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Botanik und Landschaftsökologie & Botanischer Garten
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie