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Microbial production of Poly(3-hydroxybutyrate-3- hydroxyvalerate)-copolymers from starch-containing byproducts

  • Currently, plastic materials are an integral part of our lives, but their production mostly bases on fossil fuels or derivatives, which resources are decreasing. Extraction and processing of non-renewable resources have also negative impact on environment. One of the most promising and environmentally friendly approaches is use of microorganism. This PhD dissertation presents the non-conventional yeast Arxula adeninivorans as a host for production of bio-based and biodegradable poly(hydroxyalkanoates) plastics poly(hydroxybutyrate) and co-polymer poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate). Additionally, the constructed yeast strain was able to secrete enantiomerically pure (R)-3-hydroxybutyric acid. The production of PHAs requires three enzymes: β-ketothiolase, acetoacetyl-CoA reductase and PHA synthase. The strategy followed in this project was divided into two parts. While all three enzymes are responsible for intracellular production of PHA polymer, first two only lead to secretion of (R)-3-HB into culture media, which was used in a first stage of work to establish and optimize polymer production. Both, different bacterial strains and yeast A. adeninivorans were taken into account in screening of the genes encoding aforementioned enzymes. Bacterial genes were chemically synthesized using codon optimization pattern and endogenous genes were obtained using PCR and genomic DNA template from A. adeninivorans LS3 wild-type strain. Each gene was cloned into Xplor2 vector between TEF1 constitutive promoter and PHO5 terminator. Vector containing both thiolase and reductase genes was used for A. adeninivorans transformation. The best combination of heterologous genes was overexpression of β-ketothiolase gene from Clostridium acetobutylicum and acetoacetyl-CoA reductase gene from Cupriavidus necator which led to secretion of 4.84 g L−1 (R)-3-HB, at a rate of 0.023 g L−1 h−1 over 214 h in shaking flask cultivation. Further optimization by fed-batch culturing with glucose as a carbon source did not improve (R)-3-HB secretion, but the rate of production was doubled to 0.043 g L−1 h−1 [3.78 g L−1 of (R)-3-HB at 89 h]. The product of acetoacetyl-CoA reductase is (R)-3-HB-CoA and further removing of CoA moiety is needed for acid secretion into culture media. A. adeninivorans is able to conduct this process without any additional modification but the conversion rate is unknown. Two thioesterases, cytosolic TesBp encoded by TesB gene from E. coli and mitochondrial ATes1p encoded by ATES1 gene from A. adeninivorans, were analysed to enhance secretion process. Additionally, a cytosolic version of ATES1 gene (ATES1cyt) was tested. All three genes were expressed in A. adeninivorans cells under TEF1 constitutive promoter together with thiolase and reductase genes. Despite detected enzymatic activity the yield of (R)-3-HB synthesis and secretion was not increased. Moreover, overexpressed thioesterases negatively influenced cell growth, indicating that they act on other metabolic components. The results provided two sets of information, first, the endogenous secretion system is sufficient for (R)-3-HB production; second, further screening of suitable genes needs to be performed. Based on optimization of (R)-3-HB synthesis, thiolase gene (thl) from C. acetobutylicum and reductase gene (phaB) from C. necator were chosen to combine with PHA synthase gene (phaC) for creating the PHB-V producing strain. The PHA synthase expression module, containing TEF1 promoter and PHO5 terminator, was cloned into Xplor2 vector together with thiolase and reductase expression modules and used for A. adeninivorans transformation. The engineered strain accumulated up to 7.47% PHB of dcw. During the set of cells passaging A. adeninivorans lost the ability to accumulate polymer with maximal 23.1 % of primary accumulation level. Additionally, use of a vector including hygromycin B antibiotic resistance marker (instead of auxotrophic marker in Xplor2) did not improve polymer accumulation and stability. To counteract the effect of loss of accumulation stability, phasin gene (phaP1), originated from C. necator, was introduce together with PHA pathway genes. First screening cultivations resulted in stabilizing of polymer production reaching 9.58 % PHB of dcw and only 12.0 % loss of production ability. Further experiments increased PHB content with 19.9% PHB of dcw (3.85 g L-1) after 180 h of cultivation using rich medium. Use of another thiolase gene, the second thiolase from C. necator (bktB), which theoretically should induce production of PHBV copolymer, led to accumulation only 11.4% PHB of dcw after 139 h and no PHV fraction was detected. Variation of the ratio between flask volume and amount of media influences the level of aeration. Importantly, decrease of aeration level significantly increased polymer synthesis. Additionally, PHB-V copolymer accumulation has been induced by use of different carbon source co-substrates. Use of rich media supplemented with ethanol allow the strain with thl thiolase to accumulate up to 42.9 % PHB of dcw without PHV fraction and with bktB thiolase to 30.5 % PHB of dcw. Nevertheless, despite of lower total amount of polymer, supplementation with 1-propanol allow both strains to accumulate PHB-V copolymer with 7.30 %mol and 22.5 %mol of PHV for thl and bktB strains, respectively. Optimization based on genetic engineering further enhanced polymer production yield led to exceeding of 50 % PHB-V of dcw. For doubling the gene dosage, PHA synthesizing strains of A. adeninivorans were again transformed with Xplor2 vector containing PHA pathway genes. Resulting strains exhibited twice the level of enzymatic activities of thiolase and reductase compared with strains transformed once with expression vector. In a shaking flask experiment the strain transformed twice with vector containing bktB thiolase reached after 240 h 52.1% PHB-V of dcw (10.8 g L-1) with 12.3 %mol of PHV fraction which is the highest level found in yeast. As another genetic approach, a fusion strain has been created. Two different strains have been established and merged using protoplast fusion technique. Doubling of genetic material resulted in similar level of copolymer produced by Arxula as in former experiments (50.2% of dcw, 10.7 g L-1). Culture conditions were optimized in controllable cultivation using fed-batch mode. Although optimal oxygen and pH level and continuous carbon source and nitrogen feeding were maintained, final polymer level in % of dry mass was around three times lower than for shaking flask experiment. Nevertheless, efficient growth of Arxula in fed-batch mode led to increase of total copolymer level in g L-1 (16.5 g L-1 compare to 10.8 g L-1 for shaking flasks) showing the feasibility of using Arxula strain for up-scaling production of copolymer. Acetyl-CoA is a main precursor in synthesis of PHB-V copolymer and change of its pool was investigated. ATP citrate lyase is a cytosolic enzyme converting citrate into oxaloacetate and acetyl-CoA, supporting the biosynthesis of fatty acids. Two genes encoding Acl subunits from Aspergillus nidulans (AnAcl1 and AnAcl2) were again cloned into Xplor2 vector and transformed into A. adeninivorans PHA producing strain. Despite of higher enzymatic activity of AnAclp, accumulation of polymer was around three times higher for control without expression of lyase genes. Expectedly, the strain expressing AnAcl1/2 genes accumulated larger amount of each stearic, palmitic and oleic acid in both standard and fatty acid inducing conditions (lower nitrogen level). Thus, overexpression of AnAcl1/2 genes in A. adeninevorans cells may improve biosynthesis of fatty acids but is ineffective for PHB polymer accumulation. The aim of the project was use of starch-based media, manufactured as by-products, for polymer production. Genetically engineered Arxula strains were cultivated using these media instead of glucose-based media. Although yeast cells were both able to secrete (R)-3-HB and to accumulate PHB, the yield was lower than for previous media. Additionally, only trace of PHV was found at the end of cultivation time when 1-propanol was supplemented. Obtained results showed that use of cheaper media is a promising approach to decrease production costs but further optimization needs to be performed especially for extended scale of production. Determination of produced copolymer has been done based on microscopic analysis and studies of physical and chemical properties. Results revealed that Arxula accumulated PHA polymer in cytosolic granules with a similar size range compared to the ones produced by bacteria. The physicochemical study showed that produced polymer exhibited slightly different properties in comparison to bacterial polymer with similar content of PHV, i.e. very-low molecular mass, higher melting and glass transition temperature. All above results showed that A. adeninivorans is a promising host for PHB-V production. Expression of phasin greatly increased production and stability of polymer, which led to an accumulation level never found before in yeast. Further optimization in higher production scale using cheap starch-based media may establish Arxula strain as a valuable tool for industrial production of PHB-V copolymer.
  • In der heutigen Zeit sind Kunststoffmaterialien ein fester Bestandteil unseres Lebens, aber ihre Herstellung basiert noch immer hauptsächlich auf fossilen Rohstoffen, deren Vorkommen stetig abnehmen. Gewinnung und Verarbeitung dieser nicht-erneuerbaren Rohstoffe bringen darüber hinaus negative Auswirkungen auf die Umwelt mit sich. Einer der vielversprechendsten und umweltfreundlichsten Ansätze stellt die Verwendung von Mikroorganismen zur Bereitstellung der Ausgangsstoffe bzw. zur direkten Synthese der Polymere dar. Die vorliegende Arbeit stellt die nicht-konventionelle Hefe Arxula adeninivorans als Wirt für die Produktion der bio-basierten und biologisch abbaubaren Polyhydroxyalkanoate Poly(Hydroxybutyrat) und Poly(3-Hydroxybutyrat-Co-3-Hydroxy¬valerat) vor. Darüber hinaus konnte auf diesem Weg Enantiomeren-reine (R)-3-Hydroxy¬buttersäure durch diese Hefe synthetisiert und ins Kulturmedium sezerniert werden. Die Herstellung von PHAs erfordert drei Enzyme: β-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase und PHA-Synthase. Zunächst wurde die PHA-Synthese mit A. adeninivorans in zwei Abschnitte unterteilt. Während alle drei genannten Enzyme für die intrazelluläre Synthese von PHA verantwortlich sind, führen die ersten beiden nur zur Sekretion von (R)-3-Hydroxybuttersäure in das Kulturmedium. Dies wurde im ersten Schritt zur Auswahl und Optimierung der entsprechenden Gene für β-Ketothiolase und Acetoacetyl-CoA-Reduktase verwendet. Dabei wurden sowohl verschiedene Bakterienstämme als auch die Hefe A. adeninivorans als potentielle Gen-Donoren untersucht. Bakterielle Gene wurden chemisch, unter Verwendung eines Codon-Optimierungsmusters, synthetisiert. Endogene Gene von A. adeninivorans LS3 wurden mittels PCR aus genomischer Wild-Typ-DNA amplifiziert und isoliert. Jedes Gen wurde in den Xplor2-Vektor zwischen den konstitutiven TEF1-Promotor und den PHO5-Terminator kloniert. Die aus diesem Prozess resultierenden Vektoren mit entsprechenden Thiolase- und Reduktase-Genen wurden für die Transformation von A. adeninivorans verwendet. Die höchste Konzentration an 3-HB in Schüttelkulturen von 4,84 g L-1 wurde nach 214 h mit einer Produktivität von 0,023 g L-1 h 1 unter Verwendung der Gen-Kombination aus C. acetobutylicum β-Ketothiolase und Cupriavidus necator Acetyl-CoA-Reduktase erreicht. Durch Fed-Batch Kultivierung unter Zugabe von Glucose konnte die Sekretion von 3-HB nicht erhöht werden, jedoch wurde die Produktivität auf einen Wert von 0,043 g L-1 h-1 verdoppelt [3,78 g L−1 (R)-3-HB nach 89 h]. Das eigentliche Produkt der Acetoacetyl-CoA-Reduktase ist (R)-3-HB-CoA, daher ist die Entfernung der CoA-Einheit für die Sekretion von 3-HB ins Kulturmedium erforderlich. A. adeninivorans kann diesen Prozess ohne zusätzliche Modifikation durchführen, aber die Geschwindigkeit dieses Schrittes ist unbekannt. Zwei Thioesterasen, cytosolische TesBp und mitochondriale ATes1p, die durch das TesB-Gen aus E. coli beziehungsweise durch das ATES1-Gen von A. adeninivorans kodiert werden, wurden analysiert, um den Sekretionsprozess zu verbessern. Zusätzlich wurde eine zytosolische Version des ATES1-Gens (ATES1cyt) erstellt und getestet. Alle drei Gene wurden in A. adeninivorans-Zellen unter Kontrolle des konstitutiven TEF1-Promotor zusammen mit Thiolase- und Reduktase-Genen exprimiert. Trotz nachgewiesener enzymatischer Aktivität wurden - im Vergleich zu Stämmen ohne zusätzliches Thioesterase-Gen - keine erhöhten Konzentrationen an 3-HB detektiert. Darüber hinaus hatten überexprimierte Thioesterasen einen negativen Einfluss auf das Zellwachstum, was auf deren Einfluss auf Stoffwechselkomponenten hindeutet. Aus diesem Grund wurde das endogene Sekretionssystem von A. adeninivorans als ausreichend für die Synthese von 3-HB angenommen. Des Weiteren muss das Screening nach passenden Genen zur Erhöhung der 3-HB-Sekretion fortgesetzt werden. Basierend auf den Ergebnissen zur Optimierung der (R)-3-HB-Synthese wurden das Thiolase-Gen (Thl) aus C. acetobutylicum und das Reduktase-Gen (PhaB) aus C. necator zur weiteren Stammkonstruktion ausgewählt. Zur Ermöglichung der Synthese von PHA-Polymeren mussten diese mit dem PHA-Synthase-Gen PhaC kombiniert werden. Das PHA-Synthase-Expressionsmodul, das den TEF1-Promotor und den PHO5-Terminator enthält, wurde zusammen mit den Thiolase- und Reduktase-Expressionsmodulen in den Xplor2-Vektor kloniert und für die Transformation von A. adeninivorans verwendet. Der konstruierte Stamm akkumulierte bis zu 7,47% PHB bezogen auf die Zelltrockenmasse. Jedoch verloren die Stämme nach mehrmaligem Passagieren in Hefeminimal- und YPD Medium ihre Fähigkeit zur Akkumulation von hohen Konzentrationen an PHB. Die Polymerakkumulation erreichte nur noch 23,1% des zuvor erreichten Niveaus. Dieser Umstand konnte nicht durch den Einsatz des dominanten Markers Hygromycin B korrigiert werden, sodass weitere Ansätze untersucht wurden. Um dem Effekt des Verlustes der Akkumulationsstabilität entgegenzuwirken, wurde das von C. necator stammende Phasin-Gen (PhaP1) zusammen mit den Genen des PHA-Synthese-Weges eingeführt. Dies führte in ersten Kultivierungen zu einer Stabilisierung der Polymersynthese mit einer Akkumulation von 9,58% PHB bezogen auf die Zelltrockenmasse und einem Verlust der Produktionsfähigkeit von nur 12,0%. Weitere Experimente erhöhten den PHB-Gehalt auf 19,9% PHB der Zelltrockenmasse (3,85 g L-1) nach 180 h Kultivierung in Vollmedium. Die Verwendung eines anderen Thiolase-Gens, der zweiten Thiolase von C. necator (BktB), die – theoretisch – die Produktion von PHB-V-Copolymer induzieren sollte, führte nach 139 h zu einer Akkumulation von nur 11,4% PHB bezogen auf die Zelltrockenmasse und es konnte keine PHV-Fraktion nachgewiesen werden. Die Polymerakkumulation wurde stark durch den Grad an Belüftung, infolge variierender Verhältnisse von Kolben- und Medienvolumen, beeinflusst. Dabei nahm die Akkumulation mit steigendem Belüftungsgrad ab. Zusätzlich wurde die Akkumulation von PHB-V-Co-Polymeren durch die Verwendung von verschiedenen Co-Substraten induziert. Durch Zusatz von Ethanol zum Vollmedium akkumulierte der Stamm mit Thiolase bis zu 42,9% PHB der Zelltrockenmasse ohne PHV-Fraktion. Der Stamm mit bktB-Thiolase akkumulierte dagegen nur bis zu 30,5% PHB der Zelltrockenmasse. Trotz der geringeren Gesamtmenge an Polymer ermöglicht es die Zugabe von 1-Propanol beiden Stämmen PHB-V-Copolymer mit 7,30 Mol-% und 22,5 Mol-% PHV für Thl bzw. BktB zu akkumulieren. Durch weiterführende genetische Optimierung konnte der PHB-V Gehalt auf über 50% der Trockenmasse gesteigert werden. Hierfür wurden die PHA synthetisierenden Stämme von A. adeninivorans erneut mit dem Xplor2-Vektor transformiert, sodass die daraus erhaltenen Stämme einen doppelten Satz der Gene des PHA-Synthese-Weges enthielten. Aufgrund der nun verdoppelten Expression dieser Gene war die Aktivität der Enzyme Thiolase und Reduktase zweimal höher im Vergleich zum Ausgangsstamm, der nur ein Gen-Set enthält. Im Schüttelkolbenexperiment erreichte ein Stamm, der zweimal den bktB-Thiolase enthaltenden Vektor enthielt, einen Gehalt an PHB-V von 52,1% der Trockenmasse (10,8 g L-1) mit einem PHV-Anteil von 12,3%Mol. Dies war der höchste Gehalt, der bis dahin in Hefen gemessen wurde. Ein weiterer Ansatz stellte die Konstruktion eines Fusionsstammes mittels Protoplastenfusion dar, wodurch ebenfalls die Expression der PHA-Synthese-Gene verdoppelt wurde. Hiermit konnten mit den Doppeltransformanden vergleichbare Ergebnisse erzielt werden (50,2% PHB-V bezogen auf Trockenmasse, 10,7 g L-1). Zur Optimierung der Kultivierungsbedingungen wurden Fed-Batch Fermentationen mit geregelter Sauerstoffkonzentration, pH-Wert und Temperatur durchgeführt. Trotz Zufuhr von C- und N-Quelle konnte nur ein Drittel des PHB-V-Gehaltes im Vergleich zu den Schüttelkolbenkultivierungen erzielt werden. Trotzdem führte ein effizientes Wachstum während der Fermentationen zu einer Erhöhung der Gesamtpolymerproduktion auf 16,5 g L-1 im Vergleich zu 10,8 g L-1, die in Schüttelkultur erreicht wurden. Aus diesem Grund kann der final erhaltene Stamm für eine Maßstabsübertragung der PHA-Synthese verwendet werden. Für eine weitere Optimierung der PHB-V-Synthese wurde der zellinterne Umsatz von Acetyl-CoA, dem wichtigsten Metaboliten des PHA-Synthese-Weges, untersucht. ATP-Citrat-Lyase, ein zytosolisches Enzym, spaltet Citrat in Oxalacetat und Acetyl-CoA und unterstützt so die Fettsäuresynthese. Die Gene, die für die beiden Untereinheiten (AnAcl1 und AnAcl2) dieses Enzyms codieren, wurden aus Aspergillus nidulans isoliert, wiederum in den Xplor2-Vektor inseriert und zur Transformation des PHA synthetisierenden A. adeninivorans Stamm verwendet. Trotz der höheren enzymatischen Aktivität von AnAclp war die Polymer-akkumulation im Kontroll¬stamm ohne Expression von Lyase-Genen etwa dreimal höher. Erwartungsgemäß akkumulierte der Stamm mit Expression von AnAcl1/2 aber eine höhere Menge an Stearin-, Palmitin- und Ölsäure, sowohl unter Standard- als auch unter Fettsäure-Synthese-induzierenden Bedingungen (niedrigerer Stickstoffgehalt). Die Überexpression von AnAcl1/2 in A. adeninivorans-Zellen kann zwar die Fettsäuresynthese verbessern, ist aber für die Akkumulation von PHB unwirksam. Ziel des Projektes war die Verwendung von Stärke-basierten Nebenprodukten der weizen-verarbeitenden Industrie zur Synthese von PHA-Polymeren. Die genetisch veränderten Arxula-Stämme wurden unter Verwendung dieser Nebenprodukte anstelle von Glukose kultiviert. Obwohl Hefezellen in der Lage waren, sowohl (R)-3-HB zu sekretieren als auch PHB zu akkumulieren, war die Ausbeute im Vergleich zu zuvor beschriebenen Versuchen geringer. Zusätzlich konnten am Ende der Kultivierungszeit nur Spuren an PHV detektiert werden, wenn 1-Propanol zur Kultivierung hinzugefügt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung billigerer Medien ein vielversprechender Ansatz zur Senkung der Produktionskosten ist, jedoch müssen weitere Optimierungen durchgeführt werden, insbesondere in Bezug auf die industrielle Produktion. Die Bestimmung des hergestellten Co-Polymers wurde basierend auf mikroskopischen Analysen und Untersuchungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften durchgeführt. In den Aufnahmen konnten zytosolische Granulae als Form der Polymerakkumulation identifiziert werden. Die Größe der Granulae entsprach dabei der Größe der in PHA-akkumulierenden Bakterien vorkommenden Polymerpartikel. Bei der Untersuchung der physiko-chemischen Eigenschaften konnten gegenüber vergleichbaren bakteriellen Polymeren leicht verschiedene Eigenschaften ermittelt werden. Dazu gehören eine kleine Molmasse, eine höhere Schmelztemperatur sowie eine höhere Glasübergangstemperatur. Alle obigen Ergebnisse zeigten, dass A. adeninivorans ein vielversprechender Wirt für die PHB-V-Produktion ist. Die Expression von Phasin erhöhte die Produktion und Stabilität des Polymers stark, was zum bisher höchsten, für Hefezellen beschriebenen Akkumulationsniveau führte. Eine weiterführende Optimierung der kostengünstigen, stärkebasierten Medien könnte den in dieser Arbeit erhaltenen Stamm als wertvolles Werkzeug für die industrielle Produktion von PHB-V-Co-Polymeren etablieren

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Author:PhD Mateusz Biernacki
Title Additional (German):Mikrobielle Produktion von P-(HB-HV)-Copolymeren aus stärkehaltigen Nebenprodukten
Referee:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller, Prof. Dr. Volkmar Passoth
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2019/05/24
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/02/01
Release Date:2019/05/24
Tag:Starch, Yeast, poly(hydroxyalkanoates)
GND Keyword:Mikrobiologie, Stärke
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie / 572 Biochemie