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Protein Arginine Phosphorylation in Staphylococcus aureus COL

  • Reversible posttranslational modifications play an important role during the regulation of many central processes in bacterial cells. Protein phosphorylation, in particular, can influence signal transduction processes and thus enables a distinct reaction of the cell to different stress and environmental conditions. In the case of the human pathogen Staphylococcus aureus, protein phosphorylation is involved in the adaptation to changing conditions during colonisation of human hosts. For this reason, the investigation of phosphorylations in S. aureus allows a better understanding of pathophysiology and virulence of this organism. Apart from stable phosphorylations at the amino acids serine, threonine and tyrosine, insights into energy-rich phosphorylations, for instance at arginine residues, gain more and more scientific attention. For this reason, one purpose of this study was the investigation of incidence and physiological relevance of this protein modification at a global scale. Firstly, the analysis of this modification was methodically optimised resulting in the identification of eight arginine phosphorylations in wild type cells of S. aureus COL. Secondly, the deletion mutant ΔptpB missing the gene that codes for an arginine phosphatase, was analysed. The characterisation of PtpB in vitro proved its activity and specificity towards arginine phosphorylations. This enabled the global analysis of the phosphoproteome with a focus on arginine phosphorylations. In addition to the optimisation of the phosphopeptide enrichment as part of the sample preparation, the data analysis process was adapted to the special challenges of energy-rich phosphorylations. Here, classical database search was extended by spectral library based analyses. In addition, synthetic peptides allow the generation of high quality mass spectra and the verification of database based evaluation strategies to ensure the quality of the spectral library. Next, S. aureus COL was cultivated under various conditions and several subcellular fractions were analysed with the aim to cover a broad part of the proteome. The combination of the spectra of synthetic peptides, the spectra of non-phosphorylated peptides from extensive cultivation experiments and the spectra of enriched phosphopeptides rendered the construction of a spectral library possible. This contained 2,270 proteins out of which 392 were found to be phosphorylated. A comparison of the database based analysis with spectral library based analysis showed the advantages of the latter when comparing the reproducibility of biological replicates. Thereby a permanent issue in phosphoproteomics was investigated. Hence, spectral libraries were used for the analysis of the phosphoproteome of S. aureus under control and stress conditions. 215 arginine phosphosites were identified within the mutant under control conditions and 117 under oxidative stress conditions. Oxidative stress was chosen because phenotypic characterisation of the mutant revealed that the most distinct growth changes in comparison with the wild type occurred after oxidative stress. These phenotypic changes were quantitatively approached in the last part of this work. Total proteome quantification of the wild type and mutant under control and stress conditions revealed an influence of the ptpB deletion on amino acid metabolism, oxidative stress response and virulence. The quantification of phosphopeptides by means of a combination of spectral library with Census based analysis finally confirmed the observations made during total proteome quantification.
  • Reversible posttranslationelle Modifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Regulation zentraler Prozesse in bakteriellen Zellen. Insbesondere die Phosphorylierung von Proteinen kann beispielsweise Signaltransduktionsprozesse beeinflussen und eine differenzierte Reaktion der Zelle auf Stress und Umweltbedingungen ermöglichen. So ist zum Beispiel der humanpathogene Organismus Staphylococcus aureus in der Lage, sich an die veränderten Bedingungen während der Besiedlung des menschlichen Wirtes anzupassen. Aus diesem Grund ermöglicht die Untersuchung von Phosphorylierungen in S. aureus ein besseres Verständnis der Pathophysiologie und Virulenz dieses Organismus. Neben dem Wissen über relativ stabile Phosphorylierungen an den Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin gewinnen dabei vor allem Erkenntnisse über energiereichere Phosphorylierungen, beispielsweise an Argininen, eine immer größere wissenschaftliche Aufmerksamkeit. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, Vorkommen und biologische Relevanz dieser Proteinmodifikation im globalen Maßstab zu untersuchen. Es gelang in einem ersten Schritt, die Analyse dieser Modifikation methodisch zu optimieren und daraufhin acht Argininphosphorylierungen im Wildtyp S. aureus COL zu identifizieren. In einem zweiten Schritt wurde eine Deletionsmutante analysiert, deren fehlendes Gen ptpB für eine Argininphosphatase codiert. Die Charakterisierung dieses Enzyms in vitro bewies dessen Aktivität und Spezifität in Bezug auf Phosphorylierungen an Argininresten und ermöglichte im weiteren Verlauf die globale Analyse des Phosphoproteoms mit dem Fokus auf Argininphosphorylierungen. Neben der Optimierung der Phosphopeptidanreicherung als Teil der Probenvorbereitung wurde im Zuge dieser Analyse auch die Datenauswertung an die Herausforderungen der energiereichen Phosphorylierungen angepasst. Hierzu wurde die klassische Datenbanksuche um eine Analyse mittels Spektrenbibliotheken erweitert. Mittels synthetischer Peptide konnten qualitativ hochwertige Massenspektren generiert sowie die datenbankgestützten Auswerteverfahren zur Sicherstellung der Datenqualität der Spektrenbibliothek verifiziert werden. In einem weiteren Schritt wurde S. aureus COL in einer Vielzahl von Bedingungen kultiviert und die Analyse mehrerer subzellulärer Fraktionen dazu genutzt, eine möglichst große Abdeckung des Proteoms zu erreichen. Die Kombination aus den Spektren der oben genannten synthetischen Peptide, den Spektren der unphosphorylierten Peptide aus den umfangreichen Kultivierungsansätzen sowie den Spektren der angereicherten Phosphopeptide ermöglichte so schlussendlich die Konstruktion einer Spektrenbibliothek mit 2.270 Proteinen, von denen 392 an mindestens einem Peptid phosphoryliert sind. Ein Vergleich der datenbankgestützten Analyse mit der Analyse durch die erstellten Spektrenbibliotheken zeigte im weiteren Verlauf, dass für die Analyse von Argininphosphorylierungen die spektrenbibliotheksbasierte Analyse eindeutige Vorteile in Bezug auf die Reproduzierbarkeit innerhalb biologischer Replikate aufweist und somit eine zentrale Herausforderung in der Phosphoproteomik untersucht. Deswegen wurden diese Spektrenbibliotheken für eine Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus unter Kontroll- und Stressbedingungen genutzt. So konnten in der Mutante 215 an einem Arginin phosphorylierte Peptide unter Kontrollbedingungen identifiziert werden und 117 nach oxidativem Stress. Der oxidative Stress wurde hierbei nach Wachstumsstudien zur phänotypischen Charakterisierung der Mutante ausgewählt, da diese Bedingung nach oxidativem Stress die deutlichsten Veränderungen im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Diese phänotypischen Veränderungen konnten im letzten Teil dieser Arbeit auch quantitativ adressiert werden. Im Zuge einer Gesamtproteomquantifizierung von Wildtyp und Mutante unter Kontroll- und Stressbedingungen kristallisierte sich so ein Einfluss der ptpB Deletion auf den Aminosäurestoffwechsel, die oxidative Stressantwort und die Virulenz heraus. Die Quantifizierung von Phosphopeptiden mittels einer Kombination der spektrenbibliotheksbasierten Analyse mit einer Census-basierten Auswertung ermöglichte schließlich die Bestätigung der im Gesamtproteom gemachten Beobachtungen.

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Metadaten
Author: Sabryna Junker
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-33322
Title Additional (German):Protein Arginin Phosphorylierung in Staphylococcus aureus COL
Referee:Prof. Dr. Dörte Becher, Prof. Dr. Jörg Stülke
Advisor:Prof. Dr. Dörte Becher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/11/12
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/10/30
Release Date:2019/11/12
Tag:Argininphosphorylierung, Phosphopeptidanreicherung, oxidativer Stress
GND Keyword:Massenspektrometrie, Phosphorylierung, Quantifizierung, Spektrenbibliothek, Staphylococcus aureus
Pagenumber:131
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie